1、梅毒螺旋体抗体的检测原理和临床意义,裴娟,问题及概述,实验室检测注意事项及临床意义 ? 梅毒实验室检测策略探讨,问题-1,下列哪些说法是错的？ 一旦感染梅毒，TPPA常终身阳性 TPPA可用于疗效判断 梅毒孕妇所生婴儿RPR和TPPA检测结果阳性 可诊断为胎传梅毒 RPR只能用于梅毒初筛,问题-1（续）,下列哪些说法是错的？ ELISA法不能用于初筛 核酸检测方法可以用于梅毒的血液标本检测 二期梅毒时，TPPA和RPR两种血清学试验敏感性均 可达100,问题-2,开展RPR/TRUST试验时应采用下面哪种仪器或方法进行抗原抗体凝集反应： 水平旋转仪 振荡器 手工水平摇动 混悬器,问题-3,下列
2、描述正确吗？ “TRUST法对早期、晚期梅毒检测的敏感性低及治疗后梅毒不敏感。例如一组272例抗-TP确认阳性样本，而其只检测到105例，敏感性为 38.2%” ” ，这样的说法对吗？,梅毒概述,梅毒概述,梅毒是由梅毒螺旋体引起的一种慢性、系统性的全身性传播疾病。人受感染后，螺旋体很快传播全身，几乎可以侵犯全身各个组织和器官，临床表现多样，且时显时隐，病程较长。,梅毒概述,梅毒病人是唯一的传染源。性接触传染占95%。主要通过性交由破损处传染，梅毒螺旋体大量存在于皮肤粘膜损害表面，也见于唾液、乳汁、精液、尿液、阴道分泌物。梅毒孕妇可通过胎盘使胎儿在宫内感染或出生时接触母亲有病损的产道受染。未经治
3、疗的病人在感染一年内最具传染性，随病期延长，传染性越来越小，病期超过4年者，通过性接触无传染性。,梅毒概述,临床上分三期：期（初期）梅毒：感染后3周左右局部出现无痛性硬下疳。4-8周后，硬下疳自愈。期（中期）梅毒：发生于硬下疳出现后2-8周。期（晚期）梅毒：发生于感染后2年后，亦可长达10-15年。 、期传染性强，但破坏性较小。 期螺旋体少但破坏性大，若侵害中枢神经系统和心血管，可危及生命。,梅毒概述,螺旋体抵抗力极弱，对温度和干燥特别敏感，离体后在干燥环境中1-2小时即死亡，在505分钟死亡，在4 置3天后可死亡，因此4血库存放3天以上的血液无传染梅毒的危险。对常用化学消毒剂亦敏感。,梅毒是
4、一个可以治愈的传染病,病史症状实验室依据 实验室检查结果对梅毒诊断及判愈有决定性意义 ！,常用实验室检查方法,病原学方法血清学方法,病原学检测,原理：一期、二期梅毒时，取硬下疳、扁平湿 疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得 到的组织液，在暗视野显微镜下，光线从聚光器 的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光， 从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。 方法：（1）暗视显微镜检查 （2）镀银染色法 （3）核酸检测（血液标本？） 注：梅毒螺旋体目前体外人工培养还没有获得成功， 仅能通过接种兔睾丸等部位进行有限增殖。,病原学检查,病原学检查的临床意义 ： 螺旋体检查是诊断早期梅毒的最佳方法，对
5、于患者的早期诊断、及时治疗、预后和 尽早切断传染源都有十分重 要的意义。 如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性。,血清学方法,(1) 非梅毒螺旋体抗原血清学试验 （非特异性梅毒抗体） (2) 梅毒螺旋体抗原血清学试验 （特异性梅毒抗体）问题： 为什么梅毒诊断需要上述两类血清学检测方法？,非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理,梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主可对螺旋体表面的脂质作 出免疫应答，产生抗类脂抗原的抗体（非特异性抗体）。 未经治疗的病人，其血清内的非特异性抗体可长期存在。 经正规治疗后，非特异性抗体可以逐渐减少滴度至转为阴 性。 问题： 临床上非梅毒螺旋体抗原血清学试验为什么需要做定性和
6、定量两种检测方法？,非梅毒螺旋体抗原血清学原理,方法包括： （1）快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR) （2）甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）（3）性病研究实验室试验 (VDRL)等。 基本成分是心磷脂 卵磷脂和胆固醇 抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉 眼所见 上述方法的敏感性和特异性都基本相似,非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点,1、仪器：水平旋转仪，调转速（100转/分），调转幅（18mm）。 2、定性试验 加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中， 并均匀地涂布在整个圈内 加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原 反应：水平旋转仪旋转8分钟(23 -29 ）
7、， 亮光下观察结果 (60滴/mL，1滴=17ul ),非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点,3、定量试验 血清稀释度 :1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512,非梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义,早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后 ： 一期梅毒1年后转为阴性 。二期梅毒2年后转为阴性。 晚期梅毒 治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约 50%病人血清反应仍为阳性。,非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义,非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快 速、敏感性和特异性较好。适用于大量人 群的筛查。因治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作 为疗效观察、判愈、复
8、发或再感染的指征。VDRL试验用于神经梅毒脑脊液检测特异性高，检测阳性可以作为神经梅毒确诊依 据，但敏感性较低，即检测阴性不能排除晚期神经梅毒。,非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点,假阳性反应 技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的 假阳性反应，经过重复试验即可排除。 生物学假阳性反应(一般滴度小于1:8），应采用梅毒螺旋体抗原血清学试验如TPPA等进行排 除。,非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点,由于感染梅毒后反应素的出现晚于特异性梅毒螺旋体抗体，晚期梅毒反应素又可能转阴，对隐性梅毒和神经梅毒也不敏感。因此，做梅毒初筛时，存在一定数量的漏检。,梅毒螺旋体抗原血清学试验原理,抗原为梅毒螺旋体特异蛋白
9、（包括螺旋体重组特异抗原），检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。 感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试 验呈阳性，则患者终身阳性。 问题：梅毒螺旋体抗原血清学试验的定量试验在梅毒诊疗中有意义吗？,梅毒螺旋体抗原血清学试验方法,梅毒螺旋体颗粒凝集试验 (TPPA) 梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA) 梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光免疫分析法（CLIA） 梅毒免疫层析法-梅毒快速检测 (RT) 荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS） 梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）,TPPA,TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应，具有较高
10、的敏感性和特异性。TPPA是目前WHO公认的梅毒抗原血清学试验的“ 金标准”，常用于新方法、新试剂的参照标准。,TPPA试验原理示意图,明胶颗粒+ 梅毒抗原=抗原致敏颗粒 +血液中抗体 =抗原抗体凝集 + 明胶颗粒+梅毒抗原 =抗原致敏颗粒 + 抗原致敏颗粒+血液中抗体 =抗原抗体凝集,TPPA试验结果判读敏感性,4+： 粒子光滑覆盖整个孔底，有时边缘有 折叠3+： 粒子光滑覆盖大部分底 2+：粒子光滑聚集覆盖孔底，周围有一细胞环 病期 1+： 粒子光滑集聚覆概孔底，周围有一明显细胞环 ： 粒子沉集孔底，中央形成一小点 ： 粒子紧密沉积孔底中央,ELISA/ CLIA,ELISA试验是用重组梅
11、毒螺旋体抗原包被固相 板条，加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物，形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶联 检测仪判定试验阳性反应。 本法可用于大样本血清检测。 化学发光法的临床应用意义基本同ELISA 化学发光法的敏感性？,梅毒免疫层析快速检测方法,梅毒免疫层析快速检测方法（血清、血浆法）,梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义,作为非梅毒螺旋体抗原血清试验(如RPR、TRUST等)初筛阳性标本的确证试验，排除RPR、TRUS 假阳性。 不能区分既往感染和现症感染，应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果进行诊断。 TPPA等梅毒螺旋体抗原血清试验不能作为疗效观察的指标。,梅毒血清学试验结果解释,问题：此结果
12、解释适用于先天（胎传）梅毒吗？,先天（胎传）梅毒的实验室诊断依据,查到螺旋体 。其抗心磷脂抗体滴度持续上升，可用RPR半定量试验每月检测1次，连续6个月，检测效价，效价增高或稳定在高水平，表明是先天梅毒。如抗体来自母体IgG，通常在2-3月内消失。 其抗心磷脂抗体滴度高于其母亲四倍（2个稀释滴度）。 检测抗梅毒的IgM特异性抗体阳性 。随访18个月观察抗体的变化（哪一类抗体？）,梅毒IgM抗体（TP-IgM）,IgM抗体的产生是感染后的早期体液免疫应答反 应。IgM分子比IgG较大，所以IgM抗体不能通过胎盘 屏障。而母亲的IgG抗体可以通过胎盘屏障传给胎儿。 因此若在新生儿血中检测到IgG抗
13、体不能作为先天梅毒的诊断依据，而IgM抗体可为先天梅毒的诊断依据。 IgM抗体检测其特异性较高，但敏感性较低。因 此，IgM抗体检测阴性，不能排除先天梅毒感染。,先天（胎传）梅毒的实验室诊断依据,查到螺旋体 其抗心磷脂抗体滴度持续上升（TRUST,RPR） 其抗心磷脂抗体滴度高于其母亲四倍（2个稀释滴度） 检测抗梅毒的IgM特异性抗体阳性 随访18个月观察抗体的变化（特异性抗体）,规范化梅毒实验室检测基本要求,一、根据目的选择检测方法及检测策略。二、人员 检测技术人员需经过上岗培训。接受上岗培训内容应包括：梅毒检测相关基础知识、梅毒实验室检测技术基本实验操作要求、结果解读及临床意义、质量保证与
14、生物安全等。 三、试剂 常规血清学检测应采用经国家食品药品监督管理局注册批准的 试剂。因不同厂家生产的同一种试剂的敏感性和特异性存在一定的 差异，建议选择临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。所有试剂须严格按要求妥善保存，并控制在有效期内使用。,血清学检测试剂的种类,非梅毒螺旋体抗原血清试验 ：快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR ) 甲苯胺红不加热血清试验（TRUST） 性病研究实验室试验 (VDRL) 梅毒螺旋体抗原血清试验 ：梅毒螺旋体颗粒凝集试验 (TPPA) 梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA) 梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA） 梅毒免疫层析法-梅毒快速检测 (RT) 荧光螺旋体抗体
15、吸收试验（FTA-ABS）化学发光免疫分析法（CLIA） 梅毒IgM抗体检测（IgM） 梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）,PCR技术应用于检测梅毒螺旋体DNA,特异性强，敏感性高，是目前诊断梅毒螺旋体的先进方法。(1)标本采集和处理：可采集局部分泌物、淋巴结液、羊求、血清、脑脊液等标本，用煮沸或低速离心或碱裂解等方法从标本中提取DNA模板。(2)诊断意义及评价 1)敏感性和特异性较高：尤其对无临床表现、血清学为阴性的可疑梅毒、神经性梅毒、胎传梅毒等具有较好的辅助诊断价值。 2)不能区分活的和死的螺旋体，一般不用于梅毒治疗后的复查。但死亡的梅毒螺旋体经1530天即从机体内清除，故治疗数周后PCR阳
16、性意昧着持续感染的可能。,问题1,下列哪些说法是错的？ 一旦感染梅毒，TPPA常终身阳性 TPPA可用于疗效判断 梅毒孕妇所生婴儿RPR和TPPA检测结果阳性可诊断为胎传梅毒 RPR只能用于梅毒初筛,问题-1,下列哪些说法是错的？ ELISA法不能用于初筛 .核酸检测方法可以用于梅毒的血液标本检测 二期梅毒时，TPPA和RPR两种血清学试验敏感性均可达100,问题-2,开展RPR/TRUST试验时应采用下面哪种仪器或方法进行抗原抗体凝集反应： 水平旋转仪（） 振荡器 手工水平摇动 混悬器,问题-3,下列描述正确吗？ “TRUST法对早期、晚期梅毒检测的敏感性低及治疗后梅毒不敏感，如本组272例
17、抗-TP确认阳性样本，而其只检测到105例，敏感性为 38.2%” ”。,一期梅毒实验室检查,1.暗视野显微镜检查：皮肤粘膜损害或淋巴结穿刺液可查见梅毒螺旋体。2.非梅毒螺旋体抗原血清学实验： VDRL RPR TRUST 梅毒病灶出现1-2周时，血清中反应素(抗体)阳性率为53%-83%，如感染不足2-3周，也可为阴性，应于感染后4周复查。 3.梅毒螺旋体抗原血清学实验： FTA-ABS:在第一期梅毒的头几天就可测出特异性抗体，尤其适用于与早期梅毒的诊断。 FTA-ABS-DS TPHA TPPA: TP- ELISA:此法可用于各期梅毒诊断,对感染血清灵敏度为95%. 极早期少数可为阴性。
18、,二期梅毒实验室检查,暗视野显微镜检查：二期皮损的尤其是扁湿平疣，湿丘疹及黏膜斑，可查见梅毒螺旋体。非梅毒螺旋体抗原血清学实验：阳性梅毒螺旋体抗原血清学实验：阳性,三期梅毒（晚期）实验室检查,非梅毒螺旋体抗原血清学实验：大多阳性，也可阴性。梅毒螺旋体抗原血清学实验：阳性,前带现象,非梅毒螺旋体抗原血清学实验（如RPR,TRUST）中，有时由于血清抗体水平太高，抗原抗体比例不合适，而出行弱阳性，不典型或阴性的结果，但临床上又有典型的二期梅毒症状，将血清稀释后再做血清学试验，出现了阳性结果，称为前带现象。,引起梅毒免疫学检测假阳性的因素,1.内源性：RF因子，补体，高浓度的非特异性免疫球蛋白，异嗜
19、性抗体，某些自身抗体，在ELISA测定中，可与其固相上包被的特异性抗体IgG以及随后加入的酶标抗体结合，出现假阳性。,引起梅毒免疫学检测假阳性的因素,2.外源性：标本溶血，被细菌污染，储存时间过长，标本凝固不全等。（1）血红蛋白中含有血红素基团，有类似过氧化物的活性，在以HRP为标志酶的ELISA测定中，若溶血，血红蛋白很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后加入的HRP底物反应显色。（2）标本被细菌污染，则一些细菌的内源性酶本身会对相应酶标记的测定方法产生非特异性干扰。,引起梅毒免疫学检测假阳性的因素,（3）血液凝固不全，血清中仍然残留部分纤维蛋白原，若将其加入微孔中，在温育过程中仍可形成肉眼
20、可见的纤维蛋白快，易造成假阳性。,引起梅毒免疫学检测假阳性的因素,3.在梅毒免疫学检测试验阳性的老年人中,有一些人确实是梅毒螺旋体的感染者,但有相当一部分阳性者无梅毒的任何症状与体征,配偶梅毒血清学试验均为阴性,除试验阳性外,没有诊断梅毒的任何依据。值得关注的是,非高危老年人群中的特异性梅毒血清学检查出现假阳性的情况时有发生,且阳性率较正常人群高,年龄越大阳性率越高,常常是几种试验方法检测的结果同时阳性，特别是7O岁以上的老人阳性率明显高于其他年龄段的人群。其阳性结果很难用正在或者曾经梅毒感染过来解释。假阳性反应主要是肌体的生理状态发生改变(如年龄变老)和某些疾病造成的,即使通过重复实验也是无
21、法避免。由此可见年龄与疾病因素是造成老年人梅毒抗体易发生假阳性的重要原因。,隐形梅毒,是指少数人感染了梅毒螺旋体后，在体内可终身隐伏（血清反应阳性，而无症状和病变），或在二、三期梅毒活动，局部病变消失而血清反应阳性。,隐形梅毒,产生隐性梅毒主要的原因是，梅毒未经治疗，或治疗药物剂量不足，治疗不彻底，表现为病人无临床症状，梅毒血清反应阳性。还有另一种情况，病人曾有过某种方式的感染途径，但由于病人抵抗力强，没有出现过或仅出现过非常不显著的临床症状如宫颈硬下疳，以后一直没有临床表现，但梅毒血清为阳性，这都是隐性梅毒。隐性梅毒的发生主要取决于机体本身的免疫力、治疗与梅毒螺旋体之间的较量的结果。当机体免
22、疫功能正常，或在治疗其他疾病时曾不正规地使用过与治疗梅毒有关的药物，产生了一定的治疗效果时，体内的梅毒螺旋体受到一定的限制；当机体在某阶段健康状况不佳、免疫功能降低时，梅毒螺旋体可乘机在人体内广泛活动并损害各种组织。当出现前一种情况时，即为潜伏梅毒，当出现后一种情况时，就叫做显发梅毒。,隐形梅毒,感冒药让梅毒转隐性：隐性梅毒多发的罪魁祸首是滥用抗生素。青霉素是最有效的杀梅毒螺旋体的药物，其他抗生素也有一定效果。有人患了梅毒，自己买点药吃，症状就好了；甚至有人恰好得了感冒，吃了感冒药后梅毒的症状就看不出来了，但体内的梅毒螺旋体并没有杀死，转成了隐形梅毒。梅毒治疗过程中用药剂量不足或者治疗没有彻底。临床上也有很多患者由于自身病毒抵抗力很强，症状并不显著，这也属于隐性梅毒。,
