1、,FTIRI 在骨病研究中的应用,傅里叶变换红外光谱成像系统（fourier transforminfrared imaging ，FTIRI）12应用物理2班 胡文涛 2012326690036,引言,关于FTIRI 的总结,FTIRI 系统结构介绍,FTIRI 在骨病研究中的应用,FTIRI 系统工作原理和方式,引言,关于FTIRI 的总结,FTIRI 系统结构介绍,FTIRI 在骨病研究中的应用,FTIRI 系统工作原理和方式,红外光谱用于生物物理学和生物化学进行结构分析已有大半个世纪。该方法提供了重要的结构信息，例如组织的组成，蛋白质二级结构和相互作用，DNA 构象和结构转变，脂质构象
2、的排序和相行为等。傅里叶变换红外（fourier transform infrared ，FTIR）光谱技术则是在20世纪80年代后期兴起，并在生物医学研究中发挥着越来越重要的作用。,但是这些传统的光谱技术存在很多问题，带来诸多不便。,2001年，珀金埃尔默（Perkin Elmer）公司推出一套傅里叶变换红外光谱成像（fourier transforminfrared imaging ，FTIRI）系统，即采用高灵敏度的线性阵列探测器并耦合一个可快速运动的样品台。该仪器允许红外光谱成像（Maps 或Images）以独立的样品尺寸采集，和基于FPA 开发的红外光谱成像仪器在数据采集时间和操作方
3、便性方面相比较具有更明显的优势，并降低了噪声和成本。自FTIRI 技术出现以来，虽然仪器系统较昂贵，但仍以其强大的功能在各领域发挥越来越重要的作用。,引言,关于FTIRI 的总结,FTIRI 系统结构介绍,FTIRI 在骨病研究中的应用,FTIRI 系统工作原理和方式,目前世界著名的红外光谱学显微成像系统的生产公司包括BioRad （现在是DigilabVarian） ， Perkin Elmer （PE） ，ThermoFisher Nicoli ，Bruker 等。这些红外光谱显微成像系统基本上是由红外光谱仪和红外显微镜系统两大部分组成。仅以最具代表性的PE 公司的Spotlight 30
4、0 系统为例，描述红外光谱学显微成像系统的原理和构成。,该系统是由一个红外光谱仪（Spectrum One）耦合一个Spotlight 300 显微镜装置。系统内部包含一个16 1 单元（400 m 25 m）HgCdTe （MCT） 线性阵列探测器（如引言中所述）和一个单点（100 m 100 m ）MCT 探测器，并以液氮置于Dewar 瓶中进行冷却。这两个探测器均是在液氮温度下以光敏（光电导）模式工作。二者所探测的最低光谱范围可从720 cm （后者甚至可更低一些）开始。,显微装置中配以物镜和聚光镜（condenser）实现成像的 放大，数值孔径为. 。【特定的光学设计允许样品区域在探测
5、器单元上实现 和 成像，从而达到 和. m . m 正常空间分辨率（实际的空间分辨率是和波长相关的，并由衍射限来决定的） 。光谱可以以快速扫描的模式（最大速率 pixelss）进行采集。】可见光成像（视觉影像Visual image）的收集则通过一个CCD 相机结合计算机控制（亦可手动操作）的显微镜样品台的运动来最终实现。可见光成像的收集是在白光LED 的照射下“拼接”而成。而后在可见光成像区域内选择感兴趣的区域进行红外光谱成像。因为系统集成阵列探测器和运动样品台，所以红外光谱成像数据采集速度较快。具体速度还与光谱分辨率及空间分辨率有关，分辨率越高则采集时间越长。,引言,关于FTIRI 的总结
6、,FTIRI 系统结构介绍,FTIRI 在骨病研究中的应用,FTIRI 系统工作原理和方式,根据样品的特点、性质和测量要求选择测量或成像模式，通常有反射模式和透射模式。针对不同的成像模式，所采用的载玻片也截然不同。对于透射模式，因为是实现透射测量，所采用的载玻片多是在红外波段几乎全透的BaF 晶片，从而可最大限度地减少客观条件对实验结果的影响。因为透射模式可提供最好的信噪比和较好的光谱质量，但是光谱强度却容易受到样品厚度和样品吸光度的影响，所以更适用于测量透光性较好的样品。,相比较于透射模式，反射模式则是在制样和操作上更易实现的一种成像模式。为了保证成像和光谱质量，对于载玻片亦有特殊要求。在中
7、红外波段，多采用特制的表面镀银的（lowemission）载玻片，降低了实验成本。此种载玻片对LED 发出的白光透射而对红外光反射（反透射） ，从而可顺利实现可见光成像和红外光谱显微成像，同时进一步提高红外成像的质量。,透射模式,反射模式,成像模式选择之后，将样品置于红外显微镜的样品台上，进行Z 轴方向的上下调节从而可实现LED 白光和入射红外光有效聚焦到待测样品位置。在清晰聚焦之后，调节（移动）样品台来确定可见光成像区域。在可见光成像的基础上选择ROI（region of interest）进行红外光谱显微成像。,通过样品台的精确移动和探测器对样品的同步扫描和计算机数据处理，获得ROI 的每
8、个像素的XY 坐标和红外光谱。这些探测器测量目标范围内全波段光谱的平均吸收率（或透射率） ，并采用一定的颜色（范围）来表示，即（Artifact），从而ROI 显示以彩色图像。在任意像素所对应的红外光谱上选择某特征谱带，即可衍生出该特征谱带所对应的特征基团或该基团所代表的某特征成分在样品的ROI 内的分布情况，此即成分图像（Chemical Image） 。从而可形象直观的分析样品组分、结构特征、特征基团的空间分布及其变化等。,引言,关于FTIRI 的总结,FTIRI 系统结构介绍,FTIRI 在骨病研究中的应用,FTIRI 系统工作原理和方式,传统红外光谱学可研究鉴别骨中羟磷灰石的存在和定量
9、研究骨中取代基，譬如碳酸盐和酸式磷酸盐的存在，可提供均匀分布的组织中的晶体尺寸和完整度，有利于研究骨质疏松性骨折。但是主要是针对均匀骨质。FTIRI 技术的出现则有利于进一步研究这些硬组织当中的空间异质性，即其较高的空间分辨率和丰富的光谱信息有利于研究和表征从硬组织的表面到内部的结构和成分分布差别。尽管组织化学和X 射线显微照相技术可观察到这些空间变化，但是FTIRI 技术则可提供更精确的定量描述。因此骨的异质性或不均匀性等特性决定了FTIRI 适宜进行和年龄、位置变化等相关的空间分辨的研究，从而可定量判定骨的空间含量或空间差异 、成分和性质以及饮食、环境和具体的蛋白质（发生基因突变等）的影响
10、，同时也为生物医学的研究的开辟了一个新的研究领域并提出了治疗依据。,FTIRI 最重要的应用就是对骨病的发展及修复的监测 ，用于无损表征骨样品切片的成分，阐明在骨折愈合期间以及一些流行疾病（如骨质疏松症 ）和罕见疾病（如成骨不全症和骨石化病 ）当中矿物质和基质的变化。FTIRI 可通过对矿物质的定性定量分析来研究这些疾病。,成骨不全,骨石化病,骨质疏松,骨软化症,成骨不全（osteogenesis imperfecta） ，也称骨脆症，是一种具有罕见遗传性的易碎骨病。此病的患者具有高的骨折风险，最终归因于胶原蛋白基因的变异位置。,FTIRI 提供了这样一个有利条件，从而能够弄清楚胶原蛋白分子内
11、不同的变异对矿物质沉积的影响。Atti 等采用该技术研究了骨中转化生长因子的不足对骨中矿物质和骨基质的影响。从矿物质的含量、结晶度和胶原的成熟度三个参数，以及从同一个样本选择若干个区域（从二级骨化中心到远端骨干）来表征骨的发展的几个不同阶段。结果显示受损骨的成熟机制直接涉及到生长转化因子的不足以及间接的炎性细胞因子的增加。FTIRI 技术和组织结构力学相结合还被成功地应用于测量种内变异的老鼠的骨骼中矿物和基质组成 。研究发现了矿物质基质比及碳酸盐磷酸盐比的不均匀性和结晶度变化的关系：股骨断裂暗示着矿物质基质比和碳酸盐磷酸盐比的不均匀性减少，同时骨的刚性降低的概率增加，导致断裂；结晶度的不均匀性
12、增加，则和碳酸盐磷酸盐比的减少有关。,骨石化病（Osteopetrosis） ，此病患者的骨骼象岩石般坚硬，阻碍了她们的移动且增加了她们的痛苦。很多患者中，此病的起因是骨的再吸收细胞和破骨细胞不能够对骨进行重建，导致软骨的持续钙化。FTIRI 研究数据证明了矿物质含量的增加和晶体尺寸的降低，与在患有此病的动物模型的骨内所观察到的特性是一致的 。,与其他较罕见的骨病相比较，骨质疏松症osteoporosis是一种很普通的与年龄相关的疾病。它的发生涉及到骨或骨小梁的损失。FTIRI 应用于骨质疏松症的研究之前，一系列的红外光谱和Xray 衍射研究表明：与年龄一致的健康骨骼相比较，骨质疏松症患者体内
13、的矿物质含量连续降低，而晶粒尺寸和完善程度将增加、减少或者不变。但是具体的变化方式尚未有定论。应用红外显微光谱及其成像技术恰可以完美地揭示这些变化，包括骨的超结构，能鉴别这些在正常组织和骨质疏松组织之间的重要的差别，并排除断裂面的愈合组织或者微裂缝。通过对大量患有骨质疏松症的男女患者的活检（多位置）分析，发现矿物质和基质比降低，而结晶度增加，胶原蛋白成熟度也在增加。,FTIRI 还被用于研究骨软化症（osteomalacia），其不同于骨质疏松症。【在患有骨质疏松症的骨中，矿物质的密度是逐渐减少的，骨的微体系结构被破坏，骨中非胶原蛋白的数量和种类发生变化，以上因素导致骨折的风险增加。】而对于骨
14、软化病，则是因为有缺陷的骨当中骨盐（骨中的矿物质）沉积引起的骨变软的泛称。FTIRI 研究揭示了骨中矿物质和基质的属性，发现骨软化症患者的骨小梁区域矿物质含量明显比标样的低，矿物质的结晶度在骨小梁中趋于减少 。,FTIRI 分析对骨的研究也有一些局限性。首先，因为骨是一种硬组织，薄的切片较难于制备。为了避免这个问题，骨通常被固定然后包埋在较硬的基底里面，从而可以用显微切片机进行切片制样。然而，这种方法比较耗时，而且所采用的包埋材料的光谱会覆盖骨的矿物质成分和基质成分的光谱。此外，针对于人体研究的活检样品较难于获得，因而可用于分析的样品数量以及研究结果通用性受到了限制。,引言,关于FTIRI 的
15、总结,FTIRI 系统结构介绍,FTIRI 在骨病研究中的应用,FTIRI 系统工作原理和方式,尽管FTIRI 在制样时有一定限制，但瑕不掩瑜。FTIRI技术把光谱测量和微区成像技术有效地结合起来，同时采集样品的形态学信息和光谱信息，实现了样品成分的可视化、微区化、图像和光谱分析的高精度和高灵敏度等优点。与传统的红外光谱学方法相比不仅是实验技术的重大突破，同时也开辟了很多新的研究领域，给各学科领域研究带来了深远的影响，极大地提高了科学研究的效率和光谱技术的通用性。FTIRI 系统的出现不仅为材料、化学、环境分析等学科的发展提供了有力的研究手段，同时更为生物医学领域的研究开辟的广阔的发展空间。,谢谢thankyou,By 胡文涛,
