1、梅毒实验室检测技术与评价 贵阳市疾病预防控制中心 谢 芳,学 习 内 容,一、梅毒的现状及定义二、梅毒螺旋体的生物学特性三、梅毒实验室检查方法四、梅毒血清学诊断试验五、梅毒血清学试验的结果解释六、梅毒实验室操作要求七、存在的问题,一、梅毒的现状及定义,一、梅毒的现状1、近年来我国严峻的梅毒流行形势（梅毒实验室检测不规范现状）。2、今年卫生部出台梅毒10年控制规划（梅毒血清学检测、新方法、新技术的应用性评估）3、目前我国仅对首次就诊的孕产妇制订了梅毒筛查方案，即：首先采用非梅毒螺旋体抗原血清学试验或梅毒螺旋体抗原血清学试验之一进行初筛，当筛查结果为阳性时，需用另一类试验进行复检。对一般人群尚无明
2、确的筛查诊断流程。二、梅毒的定义梅毒是一种全球分布的系统性性传播疾病。梅毒的病原体是苍白螺旋体（Treponemia pallidum，TP）。人是梅毒的唯一传染源，主要传播途径主要有性传播、血液传播和母婴传播3种，可侵犯人体全身器官，临床表现分为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒和潜伏梅毒，既能产生各种各样的症状和体征，又可多年无症状而呈潜伏状态，对人类健康危害极大。,二、梅毒螺旋体的生物学特性,1.长度为8m20m，平均8m10m，直径0.2m,有 612个螺旋。2.因其透明不易染色，故称为苍白螺旋体。3.梅毒螺旋是一种小而纤细的螺旋状微生物。4.梅毒螺旋体的特征是螺旋体整齐而规则，折光性强，较
3、其他螺旋体亮。5.运动缓慢而有规律，具有三种特征性运动方式：常见是围绕其长轴旋转前后移动；其次是全身弯曲如蛇行；少见的是伸缩其螺旋间距而前进6.梅毒螺旋体至今还不能在人工培养基上生长繁殖，目前只能将其接种到兔睾丸内增殖、传代和保存。以横断分裂的方式进行增殖，世代时间为30小时33小时。7.梅毒螺旋体在体外不易存活，煮沸、干燥，一般的消毒剂如汞剂、石炭酸、乙醇等很容易将其杀死。在4142时经过1小时2小时也可将其杀死。8.低温（-70-196）下可保存数年并保持其形态、活力及毒性。,三、梅毒实验室检查方法,梅毒的临床实验室检测方法较多，概括起来分为梅毒的病原体检查、梅毒的血清免疫学检查和梅毒的核
4、酸检查3大类。,（一）病原体检查方法,即梅毒螺旋体检查，采用暗视野显微镜检查或直接免疫荧光试验(direct fluorescent antibody test，DFA)，在显微镜下观察梅毒螺旋体的特征性形态和运动方式。该方法是诊断早期现症最直接的方法，但由于受到患者用药、检测仪器状态和检测人员技能等条件的制约，本方法实际检出率并不高。未检测到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性。本方法费时费力，也不适用于梅毒的大规模筛查。,（二）血清免疫学检查方法1,1、非梅毒螺旋体抗原试验 检测患者血清中宿主针对机体组织破坏后暴露的脂抗原或者螺旋体表面的脂质产生的非特异性抗类脂抗原的抗体(反应素)。检测方
5、法包括：快速血浆反应素环状卡片试验RPR)；甲苯胺红不加热血清(TRUST)；性病研究实验室试验(VDRL)；不加热血清反应素试验(USR)。目前最常用的是RPR和TRUST。 由于在治疗过程中反应素滴度可呈动态变化，非梅毒螺旋体抗原血清学试验常用于临床疗效观察、复发或再感染的检查。同时，由于该方法操作简便、快速，成本低，特别适合基层应用和人群调查。此类方法的缺点是反映不出既往感染，并且受其他疾病影响较大，易产生假阳性结果,（二）血清免疫学检查2,2、梅毒螺旋体抗原血清学试验 目的 检测梅毒螺旋体IgG、IgM抗体。 检测方法包括：梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）梅毒螺旋体颗血球凝集试验（T
6、PHA）梅毒酶联免疫吸咐试验（TP-ELISA）化学发光免疫分析法（CLIA）梅毒快速检测（TP-RT）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（TP-WB）。 梅毒螺旋体抗原血清学试验的共同优点是特异性强，可以作为非梅毒螺旋体抗原试验初筛阳性标本的复检或确证试验 ，但是，由于感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者长时间甚至终生阳性。所以这些方法不能区分既往感染和现症感染。亦不能作为疗效观察的指标。,（三）梅毒螺旋体核酸检查,可对血浆、血清、皮损部位组织液、淋巴穿刺液及脑脊髓液等标本的梅毒螺旋体核酸采用PCR进行检测。核酸检查的优点是特异性高，在早期梅毒、神经梅毒、先天梅毒和伴艾滋病梅毒等诊断中
7、，以及螺旋体现症感染和既往感染的鉴别诊断中具有一定的价值，也可应用于梅毒螺旋体的耐药性监测、菌株流行病学分型。该方法缺点是成本高，对实验条件要求高并且易受多种因素影响，不宜做疗效观察。,四、梅毒血清学诊断试验,目前，梅毒的实验室血清学诊断技术是检测梅毒螺旋体抗体主要方法有两类： 1.非梅毒螺旋体血清试验 2.梅毒螺旋体血清试验,（一）非梅毒螺旋体血清试验1,非梅毒螺旋体抗原试验 ：用心磷脂、卵磷脂、及胆固醇做抗原，检测宿主对梅毒螺旋体表面的类脂物质所产生的IgG和IgM抗体（抗心磷脂抗体，反应素 包括VDRL、USR 、RPR、TRUST试验等 性病研究实验室玻片试验（VDRL）：属于沉淀反应
8、，目前应用最广泛。用心拟脂、卵磷脂、胆固醇为抗原，可作定性和定量试验，操作简单，费用低，常用作大量病人的筛选及疗效观察。但在一期梅毒时敏感性不够高，以及弱阳性时判读结果困难为其缺点。 血清不需加热的反应素试验（URS）：此法在国内已逐步推广使用，也是一种非螺旋体抗原原血清沉淀试验。其原理是在VDRL所用抗原中加入了EDTA（乙二胺四醋酸）和氯化胆碱，使操作更为简单，更便于读结果，其敏感性与特异性和VDRL相同。 快速血浆反应素环状卡片试验(RPR):此试验是VDRL试验的一种改良方法。该法是在抗原中加入活性炭颗粒作为指示物，加入了氯化胆碱，因此血清不需灭活。特制的白色纸卡替代了玻片。试验结果易
9、于判断，肉眼即可观察。也可用血浆进行检测，试验结果可保存。抗原放4冰箱可保存1年。,（一）非梅毒螺旋体血清试验2,临床应用价值：简便、快速、敏感性和特异性较好可用于大规模的人群和产前筛查指示目前疾病的活动程度可作定量试验，用于疗效观察，早期梅毒经有效治疗后，抗体滴度会下降，並转为阴性，如抗体滴度不下降或下降缓慢或下降后又上升，说明治疗失败、复发或再感染。晚期梅毒可自然转阴。,材 料(以RPR为例),RPR试剂盒：含RPR抗原；直径为18mm圆圈的特制白色反应卡片；标准针头（601滴/mL）；RPR试验结果图片。其他：水平旋转器。,定性试验,a. 吸取0.05 mL血清或血浆加于卡片圈内，并均匀
10、地涂布在整个圈内（每张纸卡有10个或12个反应圈）；b. 将抗原轻轻摇匀，用标准针头吸取抗原，每个标本加1滴抗原；c. 将卡片置水平旋转器旋转8 min；d. 立即在明亮光线下观察结果。 结果中到大的黑色絮状物，液体清亮 3+4+ 强阳性小到中的黑色絮状物，液体较清亮 2+ 阳性小的黑色絮状物，液体混浊 1+ 弱阳性仅见活性炭颗粒集于中央一点或均匀分散 阴性,定量试验,RPR定量试验与TRUST试验相同。 a.在圈内加入0.05 mL等渗盐水（一般作68个稀释度）勿将盐水涂开； b. 吸取0.05 mL血清或血浆作系列稀释（1:21:64），当稀释到最后的第6孔时，弃去0.05 mL稀释液。从
11、第6孔起将血清稀释液涂布整个圈内，再涂布第5孔，依此向前到第1孔。 c. 滴加抗原，旋转时间、速度和观察结果同定性试验。,RPR试验结果,（二）梅毒螺旋体抗原血清试验,梅毒螺旋体血清试验方法有: 1.TPHA(梅毒螺旋体血凝试验) 2.TPPA（明胶颗粒凝集试验） 3.FTAABS（荧光抗体吸收试验） 4.TP-ELISA（免疫吸附试验） 5.TP-WBTP和TPLA（蛋白印迹试验） 方法简便，结果易读，适用于大量标本的检测。 FTAABS试验是“金标准”试验，具有敏感性高，特异性强等特点。不能作为观察疗效 优点：特异性高， 对非特异性试验进行证实 缺点：不能区分是新发感染或治疗后， 通常终身
12、持续阳性,梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）原理:TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒，此致敏颗粒与人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应。明胶颗粒为玫瑰红色，便于肉眼观察结果。,材 料（以TPPA为例）,a. TPPA试剂盒：含蒸馏水（标记A），用于溶解致敏颗粒、未致敏颗粒和质控血清；标本稀释液（标记B），用于稀释血清标本；致敏颗粒（标记C），冷冻干燥品，用前30 min按规定量加A液溶解并混匀；未致敏颗粒（标记D），冷冻干燥品，用前30 min按规定量加A液溶解并混匀；质控血清（标记E），冷冻干燥品，用时按规定量加入A液。b. 其他：U型微量反应板；微量加样器 (25L )
13、；微量滴管 (C和D管)；移液管 (微量移液管和刻度滴管)；微量板振荡器。,梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）,试验前试剂应恢复到1530。a. B液加至微量反应板孔内，第1孔100L， 第2孔25L，第3、4孔各25L；b. 取血清25L加至第1孔，混匀后取25L 至第2孔，混匀后取25L至第3孔，混匀后 取25L至第4孔，混匀后弃去25L。c. 第3孔加D液（未致敏颗粒）25L， 第4孔加C液（致敏颗粒）25L；d. 将反应板置振荡器振荡30 s；e. 置有盖湿盒，1525避光孵育2h后， 观察结果。,定量试验,a. 加B液至微量反应板孔，第1孔第4孔与定性试验相同，第5孔第10孔各加25
14、L；b. 取血清25L加至第1孔，如定性试验稀释方法，从第2孔第10孔混匀，混匀后第10孔弃去25L；c. 第3孔加D液25L，第4孔第10孔各加C液25L；d. 以后步骤同定性试验。结果以最高血清稀释度能产生阳性反应的稀释度为抗体滴度结果颗粒光滑覆盖整个孔底，有时边缘有折叠 阳性 4+颗粒光滑覆盖大部分孔底 阳性 3+颗粒光滑集聚覆盖孔底，周围有一颗粒环 阳性 2+颗粒光滑集聚覆盖孔底，周围有一明显颗粒环 阳性 1+颗粒沉集孔底，中央形成一小点 可疑 颗粒紧密沉积孔底中央 阴性 -,报告方法,a. 阳性报告：定性试验，血清在1:80以上稀释度与致敏颗粒发生凝集反应（1+或更强），与未致敏颗粒
15、（第3孔）不发生凝集反应。定量试验则应报告发生阳性反应的血清最高稀释度，为血清滴度。b. 阴性报告：血清与致敏颗粒和未致敏颗粒均不发生凝集反应。,注意事项,a. 微量反应板要清洁干净，孔内无异物。b. 加入血清后，使用微量板振荡器振荡反应板，而不可使用水平旋转仪。c. 试剂盒不可置于0以下，防止冻结。不同批号试剂不可混合使用。 d. 如未致敏颗粒出现凝集反应，应将血清进行吸收处理后再进行试验，或用其他试验方法。,梅毒血清反应的假阳性反应,（1）梅毒血清反应假阳性的分类 技术性假阳性反应 由于标本的保存不当（如细胞污染或溶血）、试剂质量差或过期、或实验室操作错误所造成。 生物学假阳性反应 是由于
16、患者有其他疾病或生理状态发生变化，使梅毒血清试验出现阳性（2）急性生物学假阳性反应 很多非梅毒螺旋体感染性疾病，如风疹、水痘、传染性单核细胞增多症、病毒性肝炎、上呼吸道感染、肺炎球菌性肺炎、亚急性细菌性心内膜炎、活动性肺结核、丝虫病和沟端螺旋体病等。（3）慢性生物学假阳性反应 可持续6个月以上或数年，甚至终生。,五、梅毒血清学试验的结果解释,六、梅毒实验室操作要求,1 实验室要求清洁明亮，温度保存在23 29。 2仪器设备制定详细的操作说明书，定期维护。 3玻璃器皿或耗材要清洁干净。 4试验操作要适合工作需要，操作人员要持证上岗。 5操作规程要确实可行，不得随意改变。 6. 认真精确操作标本和
17、试剂，包括各种移液器和所操作的 用具量的准确。,7定期检查说明书，操作保持与说明书的一致。8 每次试验设立阳性和阴性质控，包括反应性，介质和每次试验操作记录是否一致性；9标本不应溶血、乳糜状，应标记血浆或血清，脑脊液是否有红细胞；10常规实验室应具有一定的空间，所有试验的记录，试验鉴定，温度记录和原始数据应保留；11认真监督报告方式和记录笔误。,12. 梅毒血清学试验操作和结果分析标本的采集和分离 编号或姓名登记 采血、分离血清和贮存试剂准备 温度、器具的校正 试剂、血清和反应板恢复到试验温度 试剂鉴定试验操作 血清量的控制 试剂量的控制 旋转仪速度和时间的控制, 实验报告 核对编号或姓名 试
18、验结果分析 重复试验(结果与临床表现不符) 进一步与临床核对（病理讨论） 登记结果 发送报告,七、存在的问题,值得注意的是，临床实验室采用梅毒血清学方法检测标本时，由于方法学本身的局限性、患者的特殊情况、实验条件和试剂或仪器的状况等因素的影响，在结果判读时，可能会出现假阴性或假阳性的情况。1前带现象：是指临床上符合梅毒体征，但未经稀释血清的TRUST或RPR实验呈阴性或弱阳性，若将血清稀释后重复实验，便可出现阳性结果。原因是血清中抗心磷脂抗体过多，抑制了沉淀反应的出现。为避免此类情况，不能只做原倍血清的检测，可以同时作倍比稀释血清的滴度检测。2病程的影响：初期或晚期梅毒患者血清TRUST或RP
19、R可呈假阴性。原因是感染初期，非特异性心磷脂抗体迟于特异性抗体出现在血清中，而晚期梅毒非特异性抗体可消失。因此，RPR实验不适合一期、三期和治疗后梅毒的诊断,3温度的变化：RPR是絮状沉淀反应，温度可以改变絮状物形成的速度，可能导致RPR假阴性。4、操作不当，可能导致实验假阳性。5特殊人群导致非梅毒螺旋体抗原试验假阳性：多见于系统性红斑狼疮(SLE)、风湿热和系统性硬化等自身免疫性疾病患者，也可见于水痘、麻风和病毒性肝炎等病毒感染性疾病。此外，一些老人和炎症患者亦会出现假阳性的结果，可能和他们特殊的生理免疫状态有关。6新生儿携带被动抗体导致RPRTPPA检测阳性：由于母体血梅毒螺旋体抗体IgG可经胎盘传给胎儿，使患儿血清呈被动阳性。因此，新生儿RPR或TPPA阳性时应慎重诊断先天性梅毒。 因此，无论用何种方法检测梅毒，其结果必须与临床实际情况相结合，综合分析各种情况，科学做出诊断，及时予以治疗。,谢谢,咨询电话：08515666207,
