1、链霉素的生产,班级：生物制药1411组别：第七组,目录,一、链霉素介绍二、链霉素的生产原理三、链霉素的生产四、链霉素的质量检查和检查方法五、EHS(环境、健康、安全),一、链霉素概述,1.简介链霉素（streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12。 1943年美国 S.A.瓦克斯曼从链霉菌中析离得到，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。从此，结核杆菌肆虐人类生命几千年的历史得以有了遏制的希望。,2.链霉素的作用机理链霉素是一种氨基糖苷类药，经主动转运通过细菌细胞膜，与细菌核糖体30S亚单位的特殊受体蛋白
2、结合，干扰信息核糖核酸与30S亚单位间起始复合物的形成，抑制蛋白合成。使DNA发生错读，导致无功能蛋白质的合成；使多聚核糖体分裂而失去合成蛋白的功能，使大量氨基糖苷类进入菌体，细菌细胞膜断裂，细胞死亡。3.稳定性链霉素为白色无定形粉末，有吸湿性。易溶于水，不溶于大多数有机溶剂，强酸、强碱条件下不稳定。硫酸链霉素制剂外观为黄色粉末，密度0.38g/L,pH1.53.5，易溶于水，呈微酸性，在中性和酸性条件下稳定，碱性条件下易失效,5.用途链霉素为微生物源杀细菌剂，可有效防治植物细菌病害，例如苹果、梨火疫病、烟草野火病、蓝霉病、白菜软腐病、番茄细菌性斑腐病、晚疫病、马铃薯种薯腐烂病、黑胫病、黄瓜角
3、斑病、霜霉病、菜豆霜霉病、细菌性疫病、芹菜细菌性疫病、芝麻细菌性叶斑病。,4.结构,6.副作用1)急性毒性反应：麻木、头晕、耳聋等为多见，多在用药后10天内出现，最短者于注射后20分钟内出现麻木，持续16小时，重者可延续24小时尚不消失。亦有发生口周麻木、头晕、运动失调、头痛、乏力、呕吐、颜面潮红，严重者亦有发生大汗、呼吸困难、痉挛不易与过敏性休克区分者。但急性反应多见累积或渐次加重现象，部分病例仅在开始注射时出现反应，以后即消失。链霉素的急性反应一般认为与其所含杂质有关。,2)慢性毒性反应： 第八对颅神经损害；a)耳前庭系损害，主要表现眩晕、头痛、经常指误等。以后出现运动性共济失调等；b)耳
4、蜗系损害：一般发生较迟，常在用药数月后或停药以后发生。其主要症状是耳鸣和耳聋。 对局部的刺激：肌注局部疼痛、肿胀、无菌性脓肿等，鞘内注射可引起发热、苍白、激动、胃纳减退、抽搐、休克，严重者可导致死亡等。 对肾脏的损害：链霉素对肾脏的损害较轻，表现为蛋白尿和管型尿，部分出现肾功能暂时减退，停药后可恢复，严重的永久性肾损害并不多见。 对骨髓的抑制：表现为白细胞、血小板减少，再生障碍性贫血及血细胞全少症等。以白细胞减少常见，再障及全血细胞减少偶见。还有多毛症、结膜炎、关节痛、心肌炎、中毒性脑病等。,二、链霉素的生产原理,1.种子扩大培养原理 种子扩培是发酵工程的一个组成部分，其指将保存在沙土管、冷冻
5、干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程。其目的首先是处于接种量的需要与菌种的驯化，同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有帮助。,2.发酵原理链霉素是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素。属于氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。3.斜面孢子培养将沙土管菌种接种到斜面培养基上，经培养后既得原始斜面。斜面培养基的主要成分有葡萄糖、蛋白胨和豌豆浸汁等，其中蛋白胨和豌豆浸汁的质量对斜面孢子质量影响很大,4.摇瓶种子培养生产斜面
6、的菌落接种到摇瓶种子培养中，经过培养基即得摇瓶种子。链霉素发酵经常使用摇瓶种子来接种种子罐。种子质量以菌丝阶段、发酵单位、菌丝粘度或浓度、糖氮代谢、种子液色泽和无菌检查为指标。摇瓶种子可以直接接种子罐，也可以在扩大培养，用培养所得的子瓶来接种。摇瓶培养的培养基成分为黄豆饼粉、葡萄糖、硫酸铵、碳酸钙等。,5. 种子罐扩大培养 种子罐培养是用来扩大种子量的。种子罐培养可为23级，根据发酵罐体积大小和接种量来确定。第一级种子罐一般采用摇瓶种子接种，23级种子罐则是逐级转移，接种量一般都为10%左右。种子质量对后期发酵的影响甚大，种子必须符合各项质量要求（糖氮代谢、菌浓和菌丝阶段、效价和无菌要求），方
7、能转罐。因此在培养过程中，必须严格控制好罐温、通气搅拌和泡沫，以保证菌丝生长良好，得到合乎要求的种子。,三、链霉素的生产,1.工艺流程 种子扩培 斜面菌种一级种子培养摇瓶耳机种子培养（种子罐）发酵 发酵 原斜面孢子斜面孢子摇瓶种子小罐种子中罐种子大罐发酵液 链霉素提取发酵液的预处理离子交换脱色及精制,2.培养基的配置斜面培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚镁0.01g，琼脂20g，水1000毫升，PH7.2-7.4（配置时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）配制：按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000
8、ml。趁热分装于18ml*180ml试管，斜面以8ml为宜。分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。高压蒸汽灭菌：121灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。,2、摇瓶种子培养基：豆饼粉20g、淀粉40g、酵母膏5g、蛋白胨5g，硫酸铵3g，硫酸镁0.25g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙4g，自来水1000ml、PH7.2-7.4。配制：取干净三角烧瓶，250ml三角瓶分装培养基30-50ml，用棉塞包扎瓶口，再加牛皮纸包扎，在0.1Mpa下灭菌45-60min。3、发酵培养基：葡萄糖4%黄豆饼粉0.8%硫酸铵0.5%玉米浆1.5%磷酸盐0.01%碳酸钙0.04%豆油0.2%,3.发酵斜面孢子培养将砂土
9、管（或冷冻管）保持的链霉菌孢子接种到斜面培养基，于27下培养7天。摇瓶种子培养待斜面长满孢子后，制成悬浮液接入装有培养基的摇瓶中，于27下培养45-48小时，待菌丝生长旺盛。种子罐扩大培养取若干个摇瓶，合并其中的培养液将其接种10%于种子罐内已灭菌的培养基，通入无菌空气搅拌，在罐温27下培养62-63小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气，搅拌培养，在罐温27下，发酵约7-8天。,4.提取工艺发酵液的预处理发酵液用水稀释，草酸酸化至pH3.0左右，加热至7580C，通过离心分离或板框过滤，除去大量不溶性菌丝体、酸性蛋白、钙镁离子、培养基残渣等杂质，冷却至15以下，再用NaOH中和
10、，得到符合离子交换工艺要求的澄清链霉素原液。离子交换应用钠型弱酸性阳离子交换树脂110树脂或大孔D一152树脂进行交换，再用稀硫酸洗脱，收集高浓度洗脱液-链霉素硫酸盐溶液。此时链霉素含量由不到1浓缩到20。,然后让霉素硫酸盐溶液再经磺酸型离子交换树脂脱盐，此时溶液呈酸性，用阴离子树脂中和，得到提纯液。或用强酸性阳离子交换树脂125树脂和弱碱性阴离子交换树脂703树脂组成的混合床脱盐中和得到提纯液。脱色及精制将提纯液先经药用活性炭脱色处理，吸附色素和细菌内毒素，经减压蒸发，在45以下浓缩，得到精制液。此时链霉素含量由10左右浓缩到45。再经喷雾干燥得到白色或类白色的无菌粉末状的产品。,四、质量检
11、查和检查方法,1、性状：白色或类白色粉末，无臭或微臭，有苦味。2、酸度：取本品，加水制成每1ml中含20万单位的溶液，依法测定pH值应为4.57.0。3、溶液的澄清度与颜色：取本品5份，分别加水5ml，溶解后,溶液应澄清无色；如显浑浊，与2号浊度标准液比较，均不得更浓；如显色，与各色5号标准比色液比较，均不得更深。4、干燥失重：取本品，以五氧化二磷为干燥剂，在60减压干燥4小时，减失重量不得过6.0。,5、异常毒性：取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含2600单位的溶液，依法检查按静脉注射法给药，观察24小时，应符合规定。6、热原：取本品，加灭菌注射用水制成每1ml中含2万单位的溶液，依法检
12、查。剂量按家兔体重每1kg注射0.5ml，应符合规定。7、降压物质：取本品，依法检查，剂量按猫体重每1kg注射3000单位，应符合规定。8、无菌：取本品，分别加入100ml0.9无菌氯化钠溶液中，使溶解，用薄膜过滤法处理后，依法检查应符合规定。另取装量10ml的0.5葡萄糖肉汤培养基6管，分别加入每1ml中含2万单位的溶液0.250.5ml，3管在3035培养，另3管在2025培养，应符合规定。,五、EHS(环境、健康、安全),1、废液、废料、发酵菌种要处理达标后排放。链霉素生产废水是一类含硫酸盐的高浓度有机废水，比值一般为，碳氮比偏低，在左右，同时废水中含有较多生化抑制物质，如甲醛、草酸、链霉素单位及其降解物等。较高浓度硫酸盐的存在对正常的厌氧消化可能会造成严重影响。2、对链霉素过敏的生产人员应避免直接接触药品。3、各项操作严格遵循SOP严防安全事故的发生及应急预案制定。,
