1、梅毒实验室检测探讨,左江成宜昌夷陵妇幼,梅毒螺旋体,梅毒是苍白螺旋体（Treponema pallidum)(又名梅毒螺旋体）感染人体所引起的一种系统性、慢性经典的性传播疾病，可引起人体多系统多脏器的损害，产生多种多样的临床表现，导致组织破坏、功能失常，甚至危及生命。临床表现复杂，称为“great imitator”，与很多疾病的临床表现和症状不易区分。5-150.1-0.2um，形似细密的弹簧，螺旋弯曲规则，平均8-14个，两端尖直，运动活泼。G-，但不易着色。Giemsa染色红色，银染色呈棕褐色。,传播途径,性接触是主要的传染途径 未经治疗的患者在感染后的1年内最具有传染性 随着病期的延长
2、，传染性越来越小？ 到感染后2年，通过性接触一般无传染性？母婴传播 在妊娠7周时，梅毒螺旋体即可通过胎盘传染未经治疗者，虽已无性传播（病期2年），但妊娠时仍可传染给胎儿，病期越长，传染性越小;输血传染,临床分期（CDC）,一期：发生在感染后10-90天二期：在硬下疳出现的2-10周隐性梅毒（潜伏期梅毒：潜伏早期和潜伏晚期）：无临床症状，发生在一期和二期症状消失后，可持续几年。早期潜伏期梅毒能复发到二期梅毒 三期：感染后的10-20年神经梅毒：可发生在梅毒的任何一期先天梅毒：通过胎盘感染胎儿,临床分期(梅毒诊断标准),一期梅毒：硬下疮（潜伏期2周一4周），腹股沟或患部近卫淋巴结肿大。二期梅毒：可
3、有一期梅毒史，病期在2年以内。皮损，全身浅表淋巴结肿大， 可出现梅毒性骨关节损害、眼损害、内脏及神经系统损害等。三期梅毒（晚期梅毒）：可有一期或二期梅毒史。病期2年以上。 晚期良性梅毒：皮肤黏膜损害，骨梅毒、眼梅毒、其他内脏梅毒。神经梅毒，心血管梅毒隐性梅毒（早期和晚期）：无任何梅毒性的症状和体征早期隐性梅毒：病期在2年内， 晚期隐性梅毒：病期在2年以上。胎传梅毒（先天梅毒）：生母为梅毒患者或感染者,梅毒的诊断,诊断依据流行病学临床表现实验室检查,梅毒螺旋体不能培养早期梅毒应用直接检测方法，但假阴性率高（达30%）大多数现症病人无临床表现或临床表现不明显梅毒的诊断必须要用血清学方法检测非梅毒螺
4、旋体抗原血清学试验梅毒螺旋体抗原血清学试验,二、梅毒感染现状,本地区梅毒螺旋体感染情况,近年患者TPAb和TRUST阳性率,本地区梅毒感染情况总结,梅毒感染呈现逐年增多趋势女性多于男性年龄分布主要集中在20-40岁之间梅毒患者多来自门诊，但不自觉的现症感染者逐渐增加。 注：非严谨统计数据！,三、梅毒的实验室检测,梅毒实验室检测,直接检测（病原学检测）血清学检测,直接检查方法（病原学检测）,兔感染试验 (RIT)显微镜检测暗视野检查(DF) 镀银染色法直接荧光法PCR,兔感染试验,原理：梅毒螺旋体感染兔的睾丸或眼结膜感染材料：脑脊液，羊水，损伤部位分泌物，淋巴结抽吸物敏感特异报告1-2个细菌即可
5、感染有价值，但临床检测欠实用,梅毒螺旋体暗视野检查,原理聚光器中央黑漆遮蔽，光线只可从其圆周边缘斜角射到载玻片上。若斜射光线遇到载玻片上的螺旋体等会发光显现。取材：同前，(但要除口腔损伤部位的取材!)敏感性：105 Tp/mL特异性：技术人员水平和 操作熟练程度,直接荧光抗体染色和镀银染色,原理：梅毒抗体或抗抗体标记荧光物质，与涂片中的梅毒螺旋体发生抗原抗体反应，荧光显微镜下观察荧光形态。取材:损伤部位涂片，浓缩体液，组织刷片，固定或非固定组织特异性：与抗体有关（单克隆，多克隆抗体）敏感性：与梅毒螺旋体数量相关，单克隆抗体检测福尔马林固定的组织时优于多克隆抗体 无SFDA批准的商品试剂（荧光抗
6、体）,TP核酸检测,原理：扩增梅毒螺旋体特异的DNA或RNA序列取材：除之前标本外，还可检测血清，血浆敏感性：不同标本差异很大特异性：与引物设计 ，人员技术，实验条件有关。无SFDA批准的商品试剂盒,直接检测的建议,暗视野法适用于一二期梅毒检测，但要注意区别口腔螺旋体和其它共生螺旋体。血清学检测始终要与直接检测联合应用，直接检测阳性不等于血清学阳性，但仍然应该作为梅毒阳性。对高度怀疑为梅毒患者，如果血清学和DF阴性，可选择性应用DFA-TP和 PCR。PCR对对血液，血清，血浆和CSF检测作用有限。 新生儿脑脊液兔感染实验（RIT）检测梅毒非常敏感，RIT和PCR检测羊水有相同的敏感性 。注意
7、病原学直接检测的安全,病原学检查的临床意义,病原学方法直接镜检到梅毒螺旋体，在临床可确诊梅毒，且具有快速、方便、易操作的特点。 螺旋体检查是诊断早期现症梅毒的最佳方法，对于患者的早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源都有十分重要的意义。 如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性。,梅毒血清学检测方法,梅毒血清学检测原理,当人体感染梅毒螺旋体后4周10周左右，血清中可产生一定数量的抗类脂质抗原的非特异性反应素（主要是IgM、IgG）和抗梅毒螺旋体抗原的特异性抗体（主要是IgM、IgG)。,梅毒抗体产生时间,梅毒血清学试验分类,非梅毒螺旋体抗原血清试验（非特异性梅毒抗体）VDRL、USR、R
8、PR、TRUST梅毒螺旋体抗原血清试验（特异性梅毒抗体）TPHA、TPPA、FTA-ABS、ELISA、CIA、ICA、WB,非梅毒螺旋体抗原血清学试验,原理：梅毒螺旋体一旦感染人体，人体迅速对被损害的宿主细胞以及梅毒螺旋体细胞表面所释放的类脂物质作出免疫应答，在3周4周产生抗类脂抗原的抗体（反应素reagin）。这些抗体主要是IgG和1gM型混合抗体。抗体作用无保护作用，治疗监测。未经治疗的病人，其血清内的反应素可长期存在。经正规治疗后，反应素可以逐渐减少至转为阴性。,试验方法,VDRL venereal disease research laboratory 性病研究实验室（玻片试验）US
9、R unheated serum reagin 血清不需加热的反应素（玻片试验）TRUST toluidine red unheated serum test 甲苯胺红血清不需加热试验RPR rapid plasma reagin 快速血浆反应素环状卡片试验,实验原理,心磷脂、卵磷脂及胆固醇+反应素=絮状凝集心磷脂：形成抗原抗体反应卵磷脂：可加强心磷脂的抗原性胆固醇：可增强抗原的敏感性。VDRL、 USR、 RPR和TRUST所采用的抗原成分相同，敏感性和特异性基本相似。,注意事项,实验环境温度应为23 C-29，抗原4保存冰箱，防止冻结。校准针头，抗原为60士1滴mL水平旋转仪。试验完毕，应
10、立即观察结果。注意定性试验的“前带”现象,非梅毒螺旋体血清学试验流程,100转/MIN5转幅约18mm,注意定性试验的“前带”现象,非梅毒螺旋体血清学试验结果判读,临床意义,对一期梅毒的敏感性为74%87%，二期梅毒达100%，三期梅毒34% 94%。特异性96% 99%。适用于各期梅毒的诊断。早期梅毒经治疗后血清滴度可下降或转阴，故可用于疗效观察、判愈、判定复发或再感染。VDRL试验适用于神经梅毒的脑脊液检查，特异性高，但敏感性低。,临床意义,早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后3个月，VDRL试验抗体滴度下降2个稀释度，6个月下降4个稀释度。 一期梅毒1年后转为阴性 二期梅毒2年后
11、转为阴性。 晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍为阳性。,假阳性问题,技术性假阳性由于标本的保存不当（如细胞污染或溶血）、试剂质量差或过期、或实验室操作错误所造成。生物学假阳性 (biological false-positive ,BFP) 是由于患者有其他疾病或生理状态发生变化，使梅毒血清试验出现阳性,生物学假阳性原因,妊娠SLE产生2 - 糖蛋白依赖性抗心磷脂抗体, 梅毒产生的抗体为非2- 糖蛋白依赖性抗心磷脂抗体, 两种抗心磷脂抗体之间偶可出现交叉反应自身免疫性疾病EBV 感染莱姆关节炎由伯氏疏螺旋体所致的自然疫源性疾病,生物学假阳性原因,肿瘤可能是某些肿瘤抗原
12、与心磷脂抗原存在相似的表位, 或者肿瘤患者体内产生的抗肿瘤抗体能与心磷脂抗原发生交叉反应牙周病齿垢螺旋体 老年人（可能与老年人多牙周病有关）,血清固定,耐血清性（血清固定）指经抗梅毒治疗后，非梅毒螺旋体抗原血清试验在一定时期内不阴转。早期的耐血清性常与治疗量不足或不规则治疗、复发、再感染或有神经系统梅毒等因素有关。,梅毒螺旋体抗原血清学试验,试验原理与检测方法,原理检测血中特异性抗梅毒螺旋体特异蛋白抗体（ IgG 和IgM ）。特异性IgM型抗梅毒螺旋体抗体，感染2周后即可测出。 检测方法TPPA、TPHA、TP-ELISA、ICA、FTA-ABS、CIA、WB,TPPA/TPHA,原理用梅毒
13、螺旋体致敏明胶颗粒（鸡/绵羊红细胞），此致敏颗粒与人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应。明胶颗粒为玫瑰红色，便于肉眼观察结果。特点将梅毒螺旋体超声裂解，纯化抗原疑问：抗原的成分，如何标准化？,TPPA原理示意图,TPPA试验是检测梅毒的“金标准”试验？,荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）,原理以完整形态的Nichol梅毒螺旋体作为抗原，加上经吸收剂（用Reiter株螺旋体制备而成）处理过的患者血清形成抗原抗体复合物，再加人荧光素（FITC）标记的抗人免疫球蛋白，与血清梅毒螺旋体抗体结合。在荧光显微镜下，螺旋体显示苹果绿色的荧光，即为阳性反应。,FTA-ABS试验是检测梅毒的
14、“金标准”试验？,酶联免疫吸附试验,原理该试验是用经纯化及超声裂解处理的梅毒螺旋体为抗原包被固相板条，加上梅毒血清和辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体，利用酶免疫法检测患者血清中的抗梅毒螺旋体特异性抗体。用重组梅毒螺旋体抗原包被固相板条，加上梅毒血清和酶标记抗原物（或抗人IgG抗体），形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶联检测仪判定试验阳性反应。检测IgG还是IgM？,免疫层析（胶体金）,POCT,Point-of care tests (POC) have contributed major advances to syphilis control in developing countri
15、es with a high prevalence of disease. POC testing has the potential to play a similar role in the US, but probably not using any of the existing tests. Although sensitivities (+95%) and specificities (+98%) of POC tests are comparable to other treponemal tests21,22, existing tests have very low posi
16、tive predictive values (12 months will identify many or most infants with congenital syphilis. Testing for specific IgM antibodies is useful if the test is reactive, but in cases where the test is nonreactive it does not rule out congenital syphilis. IgM may be used in concert with Tp detection thro
17、ugh immunostaining, PCR or DF microcopy. A four-fold or greater ratio of neonatal to maternal titers is rarely useful. APHL专家共识,神经梅毒实验室检查,血清学检查可能预示无症状的神经性梅毒（RPR 1:32 ）VDRL 用于CSF检查，其它包括CSF WBC cut-offs（WBC106/L，Pro500 mg/L且无其他引起这些异常的原因）， TP-PA (1:320), CXCL13. 蛋白水平和 TPHA 滴度不用于脑脊液检查。 联合检测 CSF（VDRL试验或F
18、TA-ABS试验）,?,?,?,梅毒血清学试验适用范围,CDC：传统梅毒筛查检测策略,CDC：现梅毒筛查检测策略,如果怀疑为潜伏期和一期梅毒的青霉素治疗,结合临床症状和流行病学诊断和治疗决策,结合临床症状和流行病学诊断和治疗决策,EIA和CIA方法梅毒检测策略,A: Assay所有方法检测结果7日内报告！,我国梅毒实验室检测策略,梅毒实验室检测策略,策略一采用任何一种非梅毒螺旋体抗原血清试验对样品进行初筛,策略二采用任何一种梅毒螺旋体抗原血清试验对样品进行初筛,策略一,策略二,？,？,策略一和策略二比较,策略一：非梅毒螺旋体抗原血清学试验优点：简便，经济缺点：主观，劳动强度大，生物安全风险策略
19、二：梅毒螺旋体抗原血清学试验优点：简便 、经济、大样本筛查快速、结果客观、可自动化缺点：无确诊方法,五、小结,小结,可作为梅毒感染筛查，经济简便但劳动强度大阳性往往是梅毒现症感染者，临床上即可开展治疗。定量试验可作为疗效观察的指标。阴性不能排除梅毒现症感染特异性和敏感性在不同阶段梅毒表现不同，一期和二期均较高，三期梅毒不定。存在生物学假阳性,可作为梅毒感染筛查，经济简便阳性不能确定是否梅毒现症感染者，不能作为治疗和疗效观察的指标。特异性和敏感性高。存在生物学假阳性可作为非梅毒螺旋体抗原血清学试验的确诊试验。,非梅毒螺旋体抗原血清学试验,梅毒螺旋体抗原血清学试验,小结,培训，标准化操作，杜绝有个
20、人特点的操作。对于只做RPR/TRUST的报告要注意以下情况：定性检测阴性=阴性；阴性=“前带”现象，慎重报告结果。阳性=阳性；阳性=“生物学假阳性”，强烈建议加做特异性抗体的检测。对ELISA/CIA阳性的加做RPR/TRUST定量检测，如果RPR/TRUST-,建议复查，排除梅毒感染早期。对于不一致结果（ELISA/CIA+/ TPPA -）或低值的ELISA/CIA阳性结果，考虑复查。,小结,梅毒抗原血清学试验没有金标准。FTA-ABS结果判读较为主观，与个人技术水平相关。免疫印迹法作为金标准可能是一个好的候选方法。梅毒抗原血清学试验的快速检测法（ ICA）仅推荐在没有其它方法的实验室使用，如果实验室有其它梅毒抗原血清学试验方法不推荐使用。特异性TP-IgM 检测在一期梅毒和先天梅毒的诊断中有潜在的应用前景。,2012年梅毒血清学检测试剂临床应用评估结果,本PPT资料均来源于网络，在此感谢原创作者！,感谢您的关注！,
