1、,论文答辩,欢迎各位老师指导,dthv提供：拓展培训http:/,抗癌活性肽对大肠癌LOVO细胞及相关凋亡基因的影响,学 科 专 业：外科学导 师 姓 名：王茂春 教授指 导 教 师: 苏秀兰 教授研 究 生 姓 名：白斯古楞,前言,大肠癌为人类常见的恶性肿瘤之一，病死率极高。在我国的发病率有大幅度提高，病死率也不断上升，已经位居恶性肿瘤死亡率的第45位3,4 。目前大肠癌的治疗还是以手术治疗为主，但即使结直肠癌病人接受了根治性手术，复发率仍较高，而再次手术的机会又很小5。大肠癌的高发病率与相对低存活率表明对其需要一种更有效的治疗策略，需要积极探索大肠癌生物治疗的新方法，以提高患者的生存质量，
2、延长生命，为全身治疗创造条件。,抗癌活性肽（Anticancer bioactive peptide，ACBP)是一种天然活性物质,相对分子质量小于800kd，属于小分子多肽13,14,15 。具有抑制肿瘤细胞增殖和激活免疫系统的双重作用，大量体外细胞实验和动物体内试验证明，ACBP能够抑制胃癌，卵巢癌，鼻咽癌，胆囊癌等多种肿瘤细胞的DNA合成，诱导肿瘤细胞凋亡和分化，降低肿瘤患者血液粘稠度，改善微循环，调节患癌机体无氧糖酵解，提高机体免疫力。,P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高，研究最广泛、深入的基因之一。p53分为野生型(wild-type p53,wtp53)和突变型(mutant
3、-type p53,mtp53）7 。野生型p53 对细胞的分裂和增殖起负调控作用，是抑癌基因。而p53蛋白由于不稳定，易发生突变，一旦p53发生突变，就会丧失野生型p53 基因所具有的细胞周期停滞、诱导凋亡发生、介导细胞衰老、维持基因稳定和错配基因修饰等抑癌功能，同时获得许多癌基因的特殊功能。,Bcl-2基因家族分为两大类：一类是抗凋亡蛋白，另一类是促凋亡蛋白8。bcl-2、Bcl-xl属于Bcl-2基因家族成员中抗凋亡蛋白一类。bcl-2基因能抑制细胞凋亡而延长细胞的寿命，但不能促进细胞增殖，即细胞凋亡抑制基因。,Bcl-xl基因是近几年发现的Bcl-2家族成员的代表，为抑制凋亡的蛋白，在
4、人体各组织中均有表达11。 Bcl-xl功能与bcl-2相似，能与Bak蛋白一起形成异二聚体，来中和Bak蛋白的促凋亡作用，从而抑制细胞的凋亡。,研究目的,探讨抗癌活性肽（ACBP）对大肠癌细胞株的凋亡和p53、bcl-2、Bcl-xl基因表达的影响，进一步完善抗癌活性肽对大肠癌细胞的抑制作用机制，证实其对大肠癌细胞有生长抑制的作用。,实验路线图,体外培养大肠癌lovo细胞,分为NS、5-FU、ILP三组,倒置显微镜下观察细胞凋亡RT-PCR方法检测p53、Bcl-2 、Bcl-xl基因的表达,得出结论,统计学处理,取3-4代的细胞,作用24h,实验方法,体外培养人体大肠癌lovo细胞株 实验
5、分组：将大肠癌lovo细胞株常规复苏,放入在37、5% CO2,饱和湿度的培养箱中培养。24小时更换DMEM培养基一次,待细胞融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代,取3-4代的细胞，分别加入生理盐水( 0.5mL，对照组)、5-FU ( 0.5mL，阴性对照组) 、抗癌活性肽( 0.5mL，用药组),用药24h后倒置显微镜下观察各组lovo细胞形态学改变。收集细胞加入1ml的Trizol 提取总RNA细胞总RNA鉴定：1的琼脂糖电泳来鉴定细胞总RNA，观察出现的各个条带及条带亮度。,总RNA提取步骤：,收集细胞，加入1ml的Trizol,室温静置5min,加入氯仿0.2ml/管,室温静置5min
6、,上清液转至新离心管,漩涡振荡30s后离心,弃上清，加入1ml75%乙醇洗涤,室温静置10min,弃上清，保留沉淀,溶解于适量的DEPC水中,冰上放置5min,12000g，4，离心5min,剧烈震荡混匀,一般500ml洗两次,12000g，4，离心5min,12000g，4，离心5min,12000g，4，离心5min,12000g，4，离心3min室温晾干,加入等体积异丙醇，上下颠倒,DU800紫外分光光度计测定：分别测定细胞的总RNA光密度值(OD)在260nm和280nm处的,并计算RNA的含量和纯度。要求RNAOD260/OD280值在1.5-2.0之间，浓度在500ug/ml以上的
7、符合实验条件。RT-PCR半定量方法检测抗癌活性肽（ACBP）对大肠癌lovo细胞p53、bcl-2、Bcl-xl基因表达的影响。,RT反应液配置 试剂 使用量 5PrimeScriptBuffer 4 l PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1 l Oligo dT Primer（50 M） 1 l Total RNA 根据浓度计算体积RNase Free dH2O up to 20 l 注：Total RNA用量为1ug 。反转录反应条件如下: 37 15 min *3（反转录反应） 85 5 sec（反转录酶的失活反应）,PCR反应液配制（15ul） 试剂 使用量 5P
8、rimeSTARBuffer（Mg2+ plus） 3.00 l dNTP Mixture（各2.5 mM） 1.20 l Primer 1（10 M） 0.20 l Primer 2（10 M） 0.20 l cDNA产物（10 pg/l） 3.00 l PrimeSTARHS DNA Polymerase 0.15 l 灭菌蒸馏水 up to 15.00 l,PCR引物详细序列 Sequence(5to3) Product(bp) Tm p53 F ATGAAGCTCCCAGAATGCCA 264 52 p53 R AATCAACCCACAGCTGCACA 264 52 Bcl-xl F
9、CCTGCCTGCCTTTGCCTAA 244 53 Bcl-xl R TAAACTGACTCCAGCTGTATC 244 53 bcl-2 F GGTGCCACCTGTGGTCCACCT 261 55 bcl-2 R CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG 261 55 GAPDH F CCTCAACGACCACTTTGTCA 103 50-60 GAPDH R TTACTCCTTGGAGGCCATGT 103 50-60,PCR反应条件如下 ：94 5min 1 Cycle94 30sec 52 、53或55 * 15sec 25 Cycle72 30sec 72 7min 1 Cy
10、cle4 保存注：p53退火温度为52摄氏度，bcl-2退火温度为55摄氏度, Bcl-xl退火温度为53摄氏度。,实验采用GAPDH片段作为内参照。P53、bcl-2、Bcl-xl、GAPDH引物采用Oligo 软件进行设计，由invitrogen公司合成。琼脂糖凝胶电泳 ：取PCR产物5ul，加5xLoading Buffer 2ul，2%琼脂糖凝胶电泳 110V，100mA，25min，凝胶成像仪成像并保存结果。凝胶图像分析软件半定量分析测定灰度值。,统计学分析,实验数据采用 表示，组间比较采用t 检验，两组以上比较采用方差分析，SPSS13.0 统计软件进行统计学分析。P 0.05 为
11、差异有统计学意义。,实验仪器及设备,分光光度仪 培养箱 显微镜 超净台 低温超速离心机,实验结果,加入生理盐水24h后见lovo细胞生长旺盛,形态良好呈梭形或多角形，胞质均匀透明，随时间延长变化不大。,用药前和用药24h后（倒置显微镜下，100，x400）,生理盐水组,加入5-FU 24h后见lovo细胞数量减少，部分细胞变小、变圆、折光率减弱、核浓缩等细胞凋亡形态。,用药前和用药24h后（倒置显微镜下，100，x400）,5-FU组,加入ILP 24h后见lovo细胞数量减少，部分细胞变小、变圆、折光率减弱、核浓缩等细胞凋亡形态。,用药前和用药24h后（倒置显微镜下，100，x400）,抗癌
12、活性肽组,细胞总RNA1琼脂糖电泳,细胞总RNA1琼脂糖电泳可见清晰的两条条带，分别为18S和28S。,紫外分光光度计测定： 分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的光密度值(OD),并计算RNA的含量和纯度。数据显示RNA纯度均在OD260/OD280比值1.5-2.0之间，浓度在400-2500ug/ml之间，符合RT-PCR实验条件。,RT-PCR检测p53基因RNA水平表达：,ACBP组与5-FU组p53基因RNA表达水平明显低于NS组p53基因RNA表达。,p53 RT-PCR电泳图,RT-PCR检测bcl-2基因RNA水平表达：,ACBP组与5-FU组bcl-2基因RNA表
13、达水平明显低于NS组p53基因RNA表达。,bcl-2 RT-PCR电泳图,RT-PCR检测Bcl-xl基因RNA水平表达：,ACBP组与5-FU组Bcl-xl基因RNA表达水平明显低于NS组p53基因RNA表达。,Bcl-xl RT-PCR电泳图,在ACBP组、5-FU组和NS组中GAPDH的表达,GAPDH RT-PCR电泳图,在ACBP组、5-FU组和NS组中GAPDH均有表达,大肠癌lovo细胞p53、Bcl-2、Bcl-xl基因总RNA表达（n=3， ）,注：*P0.01，*P0.01 VS NS组,讨论,抗癌活性肽(anticancer bioactive peptide，ACBP
14、)来源于经过诱导动物脏器，以现代生物技术分离、提取的一种新型抗癌生物制剂19。在将近十年多的研究中，目前已经完成了对小白鼠及大白鼠进行的急毒和长毒试验，表明ACBP对正常的生理过程及酶的代谢基本上没有干扰，未发现明显的毒副作用。,本课题组前期研究证实：通过MTT细胞毒理实验证实：ACBP抗癌作用的有效浓度为25ug/ml，最有效作用时间为24小时。ACBP：大量体外细胞实验和动物体内实验证明，ACBP能够抑制胃癌、大肠癌、白血病、卵巢癌、胆囊癌等多种肿瘤细胞的DNA合成，诱导肿瘤细胞的凋亡并使细胞向正常细胞分化，降低肿瘤病人机体血液黏稠度，提高免疫力。,本实验选用25ug/mlACBP对大肠癌
15、lovo细胞株作用24小时，观察结果可见ACBP其抑癌作用机制可能与抑制细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡有关，以进一步探讨证实ACBP的抗癌作用机理，并通过RT-PCR方法检测p53、bcl-2、Bcl-xl基因观察其在肿瘤细胞中的表达情况，为其在临床应用提供更为完善的理论依据。,肿瘤是因人体细胞中调控因子的平衡调控发生紊乱，导致细胞异常增殖而诱发的。在体内外各种致癌因素的作用下，p53基因发生缺失或突变，使其编码的蛋白质丧失了抑制细胞增值的作用，导致细胞的无限增值而引发肿瘤。变异的p53蛋白不仅丧失了阻止正常细胞发生癌变的作用，还由于突变所产生的异常功能(Gain of function)启动一些
16、原癌基因的过度表达，促进细胞的恶性转化，加速肿瘤的发生和发展22.23。,bcl-2基因是原癌基因到目前发现的与凋亡关系最密切的基因之一。正常组织中bcl-2在自身稳定性方面起着重要作用, 一般在记忆B淋巴细胞和寿命长的干细胞群及胸腺髓质细胞里较多，如:结肠、子宫内膜、前列腺和皮肤中，但在上皮细胞分化末期较少出现。bcl-2蛋白在正常细胞中可表达于激活和发育过程，也可表达于成熟组织中，在人体多种形态的肿瘤细胞中亦可表达，走向凋亡的细胞中却低表达或不表达28。,Bcl-xl的表达与恶性肿瘤的发生、发展过程相关。该基因有2种类型:一种为Bcl-xl，与bcl-2蛋白有协同作用；另一种为Bcl-xs
17、，与bcl-2蛋白有抑制作用30。Bcl-xl的功能与bcl-2比较相似，可与Bak蛋白形成异二聚体，来中和Bak基因的促凋亡作用，使抑制细胞凋亡31。研究表明, Bcl-xl/bax比例是决定细胞对凋亡刺激信号敏感的重要因素33。当Bcl-xl表达过量时，细胞可免遭凋亡，反之，在诱导剂的作用下细胞容易发生凋亡。,Bcl-2家族与p53的基因调控也是有着相互联系的。一些学者认为bcl-2能抑制p53来介导细胞凋亡, 近年来又发现突变型p53是由于其在mRNA及蛋白水平下调bcl-2表达来抑制细胞凋亡，从而成为了bcl-2的调控因子。有研究发现，p53基因失活时, 使bcl-2家族的基因调控失衡
18、，引起凋亡抑制基因Bcl-xl在mRNA水平升高，致使靶细胞不容易诱发细胞凋亡。,本试验中，通过lovo细胞培养，镜下观察和RT-PCR检测p53、bcl-2、Bcl-xl基因发现，从形态学和RNA表达两个方面的研究提示：ACBP对大肠癌lovo细胞具有抑制生长、诱导凋亡作用，可能是其治疗大肠癌的重要机制之一，同时也进一步明确了ACBP的抗肿瘤疗效。为抗癌活性肽对大肠癌的临床治疗提供了实验依据，提示其具有潜在的临床应用前景。,结论,抗癌活性肽可能通过降低细胞中p53基因的表达，下调肿瘤细胞生长与增殖能力，发挥其抗肿瘤作用。抗癌活性肽的抗肿瘤作用可能与下调大肠癌lovo细胞中bcl-2、Bcl-
19、xl基因表达，诱导细胞凋亡有关。,【参考文献】1. 姚国栋, 苏秀兰, 乌新林等. 抗癌活性肽对荷人胃癌裸鼠细胞凋亡及BcL-2、Bax表达的影响J .内蒙古医学院学报，2010.4，32（2）1031082. 温再和，苏秀兰，欧阳晓晖等. 抗癌活性肽抑制肿瘤生长和转移的研究进展J .内蒙古医学杂志Inner Mongolia Med,2005，37（1）,3436 3. 徐桂华,苏秀兰,中杰等.抗癌活性肽对人胃癌BGC-823细胞周期的调控J.中华肿瘤防治杂志，2007，14（18）：1361-1364.4. 庞利群，范钰，蒋鹏程等. RNA干扰BclxL基因表达对大肠癌细胞侵袭的影响J .
20、复旦学报，2009，36(1)，7478 5. 孙念峰，张建良，王国斌，抗凋亡基因Bag-1 和Bcl-2 在结肠癌组织的表达及相互关系的研究J中国现代普通外科进展，2008,11（5）395398 6. 赵媛媛，彭诗东，苏秀兰等.抗癌活性肽对鼻咽癌细胞周期的影响J.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2006，41（8）：607-611.,7. Qi Xie1; Biling Liang2In vivo comparison of transduction efficiency with recombinant adenovirus-mediated p53 in a human colon canc
21、er mouse model by different delivery routesJ Chinese-German Journal of Clinical Oncology，2008,12 8. Xiao-Dong Zhou; Jie-Ping Yu; Hong-Gang YuExpression of cellular FLICE-inhibitory protein and its association with p53 mutation in colon cancerJWorld Journal of Gastroenterology，2005-16-019 9. Luis Orl
22、ando Prez; Martin Carlos Abba;Evaluation of p53 codon 72 polymorphism in adenocarcinomas of the colon and rectum in La Plata, ArgentinaJWorld Journal of Gastroenterology，2006-09-018 10. Cao Jiang; Teng Lisong; Zheng Shu; Construction of p53 antisense RNA expression vector and its effect on colon can
23、cer cellsJChinese Medical Journal，1998-04-025 11. Zhenyu He a; d; Chuanbing Shi b；The potential of carcinoembryonic antigen,p53,Ki-67 and glutathion Stransferase- as clinico histopathological markers for colorectal cancerJ Journal of Biomedical Research，2010-01-00912.You-Li Zhang, Li-Qun Pang, Signi
24、ficance of Bcl-xL in human colon carcinomaJ。World J Gastroenterol，2008,14(19),30693073,13.Sandig BV ,Brand K, Herwig S , et al. p16 and p53 genest ransferred with the help of adenovirus to induce apoptictumor cell death J . Ugeskr Laeger , 1997 , 159 (46) :68256830.14.Manne U, Weiss HL, Grizzle WE.
25、Bcl-2 expression isassociated with improved prognosis in patients with distalcolorectal adenocarcinomas. Int J Cancer, 2000, 89:423430.,致谢,难忘的研究生学习即将结束，首先衷心感谢我的导师王茂春教授对我的培养和指导。导师不仅传授我专业知识，更教我做人的道理，使我有信心成为一名既有医术又有医德的好医生。您渊博的学识、精湛的医术、高尚的医德、朴实无华的作风是我一生学习的榜样。在此，向辛勤栽培我的恩师致以最诚挚的谢意！特别感谢附院临床医学研究中心苏秀兰教授对本课题的精心指导，衷心感谢苏依拉老师、张嘉玲老师、贾淑琴老师在实验过程中给予的悉心指导和热忱帮助。衷心感谢普通外科C区所有老师在我学习生涯中给予的指导、教诲和帮助。感谢你们让我在收获知识的同时，收获了友情和快乐。最后，再次衷心感谢我的师长、同学和朋友，感谢我的家人，一直默默陪伴着我！谢谢你们！,,谢 谢 ！,谢 谢 ！,
