1、 本科毕业论文 （ 20 届） 食品科学与工程 超临界 CO2 萃取荷叶中黄酮工艺的研究 摘 要 本文优化了以荷叶为原料提取黄酮类物质的工艺条件：选取乙醇为提取溶剂，通过提取压强、提取温度、提取时间 做 单因素实验， 在单因素的基础上 进行三因素三水平响应面实验， 建立了荷叶中黄酮的超临界流体提 取的 二次多项式数学模型，并以黄酮含量提取率为响应值作响应面和等高线，考察萃取压力 、 萃取温度和萃取时间对黄酮超临界提取的影响 。 结果：黄酮超临界流体提取的优化工艺条件为萃取压力 334bar；萃取温度 64 ；萃取 时间 60min。 关键词： 荷叶；黄酮类物质；提取；超临界；响应曲面分析法 A
2、BSTRACT This article optimizes the lotus leaf as raw material extraction conditions of flavonoids: Ethanol was selected as the extraction solvent. Through the extraction of pressure,temperature and time, doing three single factor experiments.In addition,based on the single factor experiments, a thre
3、e factors,three levels of response surface experiment was made,And we established a lotus leaf in the supercritical fluid extraction of flavonoids from the quadratic polynomial model.Whats more, the extraction rate of flavonoids responsed value response surface and contour, we observed the extractio
4、n pressure, extraction temperature and extraction time on supercritical fluid extraction of flavonoids.As a result, supercritical fluid extraction of flavonoids from the optimum conditions was the extraction pressure 334bar; extraction temperature was 64 ; extraction time was 60 min. Key Words: Lotu
5、s leaf; flavonoids; Extraction; Supercritical; Response surface analysis I 目 录 1 前言 . 1 2 材料与方法 . 2 2.1 实验材料 . 2 2.1.1 实验原料 . 2 2.1.2 实验试剂 . 2 2.1.3 实验仪器 . 2 2.2 实验方法 . 3 2.2.1 标准溶液配制和标准曲线的绘制 . 3 2.2.2 样品中黄酮含量的测定 . 3 2.2.3 温度对荷叶黄酮 类物质提取的影响 . 4 2.2.4 压强对荷叶黄酮类物质提取的影响 . 4 2.2.5 时间对荷叶黄酮类物质提取的影响 . 4 2.2.
6、6 超临界提取荷叶总黄酮含量的条件优化 . 4 3 结果与分析 . 4 3.1 单因素 实验结果 . 4 3.1.1 温度对黄酮得率的影响 . 4 3.1.2 压强对黄酮得率的影响 . 5 3.1.3 提取时间对黄酮得率的影响 . 5 3.2 响应面实验设计 . 6 3.2.1 响应面分析因素水平的选取 . 6 3.2.2 响应曲面分析方案及结果 . 6 3.2.3 实验数据分析 . 7 3.2.4 因素间的交互影响 . 8 3.2.5 最佳提取工艺确定 . 10 3.2.6 结论 . 10 参考文献 . 11 1 1 前言 荷叶为睡莲科植物莲的叶。睡莲为多年生水生草本 植物 ，生于水泽、池塘
7、、湖沼或水田内，野生或栽培 ， 广布于南北各地。 荷叶是 “ 药食两用 ” 的食物，荷叶中富含的黄酮类物质，是大多数氧自由基的清除剂，可以提高 SOD（超氧化歧化酶）的活力，减少 MDA（脂质过氧化物丙二醛）及 OX-LDL（氧化低密度脂蛋白）的生成，对实验性心肌梗塞有对抗作用；对急性心肌缺血有保护作用 1；对治 疗冠心病、高血压等有显著效果 2；对降低舒张压，防治心律失常、心血管病等也起重要作用，因此荷叶黄酮是一类极有价值和待开发的物质，它既可作为心血管疾病的原料药，还可广泛应用于功能食品、保健食品和饮料中。近年来，随着对植物黄酮类成分生理活性的认识不断提高，从药用植物和经济植物中开发具生理
8、活性的黄酮类成分作为天然药物和保健品的原料已日益引起重视。 目前植物提取黄酮类物质的方法主要有：有机溶剂提取法 3；微波辅助提取技术 4；超声波辅助提取法 5；超临界流体萃取 6-10。 有机溶剂提取法： 溶剂提取法主要 有水提和有机溶剂提取两种。水提法提取植物黄酮类物质早在 90 年代就有报道，该法工艺简便、成本低、纯度高，但此法提取率低。有机溶剂提取是利用 黄酮 在不同溶剂中的溶解度不同从而达到分离效果，常用的溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，此法提取率较高。 微波辅助提取技术：微波提取技术是一种利用微波能来提高提取率的技术。微波提取过程中，植物细胞内的极性物质吸收微波能转化为大量热能，
9、使细胞内液态水迅速汽化，所产生的压力在细胞膜和细胞壁上形成微小孔洞，使胞外溶剂大量进入细胞内，溶解并释放出胞内物质。 超声波辅助提取法：超声波 辅助提取法是利用超声波产生的机械效应、空化效应及热效应，加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，加速了有效成分的浸出，从而提高提取率，缩短提取时间，并可避免高温对提出成分结构的破坏。 超临界流体提取： 超临界流体萃取目前是国际上最先进的物理萃取技术， 超临界流体萃取是利用温度和压力处于临界值以上兼有液体和气体优点的流体作为萃取剂， 利用超临界流体优良的溶解力，将基质与萃取物有效分离，提取和纯化 。目前常用的萃取剂为二氧化碳。 这是因为： a）二氧化碳临界压力
10、和临界温度低，操作简便，减少了对有机成分的破坏，特别适合于处理高沸点 热敏性物质，如香精，香料；2 b）二氧化碳可看做是与水相似的无毒无害的低廉的有机溶剂； c） 二氧化碳在使用过程中稳定，无毒，安全，不燃烧，不污染环境，可避免与提取物发生氧化； d）二氧化碳提取物中不含有硝酸盐和重金属，并且无有害溶剂的残留。因此二氧化碳超临界特别适合于药物、生物、食品等的提取和纯化。 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 实验原料 荷叶 购 于四明中路大药房。 荷叶的处理 ：将荷叶粉碎，过 50目筛，放入干燥器，备用。 2.1.2 实验试剂 本研究使用的主要化学药品和试剂如下表 1 表 1 化学药品
11、与产 地 Table 1 Chemicals and origin 名称 等级 厂家 无水乙醇 分析纯 浙江中星化工试剂有限公司 二氧化碳 99.5% 浙江中星化工试剂有限公司 亚硝酸钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氢氧化钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 三氯化铝 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 2.1.3 实验仪器 表 2 主要仪器和设备 Table 2 The main instruments and equipment 名称型号 型号 制造商或产地 万能粉碎机 DJ-10A 上 海淀久中药机械制造有限公司 超临界二氧化碳萃装置 SFE-2 Applied Separation
12、s 电子精密天平 PL203 梅特勒 托利多仪器（上海）有限公司 紫外可见分光光度计 754 上海菁华科技仪器有限公司 酒精浓度计 TA-500 上海图新电子科技有限公司 超声装置 JP300 武汉真鹏电子有限公司 3 2.2 实验方法 2.2.1 标准溶液配制和 标准曲线 的 绘制 11 精密称取干燥至恒重的芦丁对照品 10mg 置于 50mL 容量瓶中，用 60%的乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀后制成 0.2mg/mL 对照品溶液。 其 原理为黄酮化合物与铝盐形成络合物，控制适宜 pH 值，在可见光区获得稳定吸收峰。分别精密量取芦丁对照液 0.00mL、 1.00mL、 2.00mL、 3.0
13、0mL、 4.00mL、 5.00mL 和 6.00mL于 25mL 容量瓶中，各加无水乙醇补足 6mL 和 5%NaNO2 1mL 混匀后静置 6min，再各加 10%A1(NO3)3 1mL，静置 6min 后滴加 10%NaOH 10mL，最后加无水乙醇至刻度，静置 12min。 已知 络合物在 510nm处有最大吸收峰，故选此波长。以芦丁对照液浓度 (mg.mL-1)为横坐标， 以吸光度为纵坐标，测得标准曲线为A=11.973C+0.0004， R2=0.9994。 y = 11.973x + 0.0004R2= 0.999400.10.20.30.40.50.60.70 0.01 0
14、.02 0.03 0.04 0.05 0.06芦丁浓度（mg/ml）吸光度（A）图 1 芦丁标准曲线 Figure 1 Standard curve of rutin 2.2.2 样品中黄酮 含量的测定 方法为 将荷叶提取物用 10ml 乙醇溶解并定容后 用吸管吸取 1ml 提取液于 25ml容量瓶中 ， 加无水乙醇至 6mL 和 5%NaNO2 1mL 混匀后静置 6min， 再各加10%A1(NO3)3 1mL， 静置 6min 后滴加 10%NaOH 10mL， 最后加无水乙醇至刻度静置 12min， 以乙醇做空白 。由于络合物在 510nm 处有最大吸收峰 ， 故选此波长。 荷叶黄酮得
15、率 = WVaY 式中 Y 由回归方程计算出的黄酮浓度， mg/mL； 4 a 稀释体积； V 提取液体积， mL； W 荷叶粉末质量， g。 2.2.3 温度 对 荷叶 黄酮类物质提取 的影响 准确称取 2.0g荷叶 粉末用棉花分三层装入 萃取釜 ，将 萃取釜 与超临界装置连接，进行萃取，所有提取过程都先静态提取 15min。 萃取条件为： 固定压强 225bar；固定时间 60min，分别对温度（ 40 ； 50 ； 60 ； 70 ； 80 ）进行提取 ， 并用棕色瓶储存 提取物 ， 冷藏备用。 2.2.4 压强对 荷叶 黄酮类物质提取 的影响 提取方法同 2.2.4，并在 提取温度为
16、60 ，提取时间为 45min， 分别对 压强（ 125bar、 175bar、 225bar、 275bar、 325bar） 条件下 进行超临界提取并用棕色瓶储存 提取物，冷藏备用 。 2.2.5 时间 对 荷叶 黄酮类物质提取 的影响 提取方法同 2.2.4，并在 提取温度为 60 ，提取压强为 225bar， 分别对 时间（ 25min， 35min， 45min， 55min， 65min）条件下进 行提取 ， 并用棕色瓶储存 提取物 ， 冷藏备用。 2.2.6 超临界提取荷叶总黄酮含量的条件优化 通过以上的单因素实验，选取对黄酮类物质提取影响 较大的因素 进行综合评价 ，进行响应面
17、设计实验， 对提取条件作进一步优化。 3 结果与分析 3.1 单因素 实验结果 3.1.1 温度 对黄酮得率 的影响 从图 2 可以看出，在萃取压力为 225bar，萃取时间为 45min 的条件下，温度在4060 时，黄酮的提取率有显著的提高，这是因为温度升高有利于溶质挥发性的增加和物料的扩散，并在 60 的时候达到最大值，随着温度的 继续 升高 ， 伴随 着二氧化碳浓度 降低 ，从而导致其溶解能力 下降，从而 不利 于 萃取 操作 12。同时温度的升高会导致部分有机物的分解，从而降低了提取率。本实验选用 45 ， 60 ， 75 作为 响应面设计 实验 的萃取温度的选定值。 5 1.351
18、.41.451.51.551.61.6530 40 50 60 70 80 90温度/ 黄酮提取率/(mg/g)图 2 温度对黄酮提取率的影响 Figure 2 temperature on extraction rate of flavonoids 3.1.2 压强 对黄酮得率 的影响 从 图 3 可以看出随着压强的增加，黄酮含量的提取量也增加。可以看出压强在175bar 以下的时候提取率很少，在 200bar 到 300bar 的时候增速最快，之后缓慢增加。为减少能耗，以及出于安全考虑，选取压力为 275bar 左右进行提取。 00.20.40.60.811.21.41.61.8100 1
19、50 200 250 300 350压强/bar黄酮提取率/(mg/g)图 3 压强对黄酮提取率的影响 Figure 3 pressure on the extraction rate of flavonoids 3.1.3 提取时间 对黄酮得率 的影响 从图 4 可以看出随着时间的延长，黄酮的提取量逐渐增加。在 35min 到 60min的时候增速是最快的，之后随着时间的增加提取率变慢。综合考虑荷叶中黄酮的含量以及超临界中二氧化碳的成本，选择 45min 作为提取时间 选定 值 。 6 1.351.41.451.51.551.61.6520 30 40 50 60 70时间/ m i n黄酮
20、提取率/(mg/g)图 4 提取时间对黄酮提取率的影响 Figure 4 extraction time on extraction yield of flavonoids 3.2 响应面实验设计 3.2.1响应面分析因素水平的选取 根据 Box-Behnken的中心组合试验设计原理， 通过以上的单因素实验，选取温度、压强、时间三个相对影响较大的因素作 响应面 实验。 试验因素与水平见表 3， 共 15个试验点， 12个为分析点， 3个为零点，零点试验进行了 3次，以估计误差。 表 3 黄酮超临界流体提取试验的因素与水平 Ta ble 3 Supercritical Fluid Extraction of flavonoids factors and levels 水平 提取温度 Z1 ( ) 压强 Z2 (bar) 时间 Z3 (min) 1 45 150 30 2 60 275 45 3 75 400 60 3.2.2响应曲面分析 13方案及结果 先对萃取温度（ Z1）， 萃取压力（ Z2）和萃取时间（ Z3）进行 编码： Xi=(Zi-Zo)/Z 式 中， Xi为各参数的编码值， Zi为各参数的真实值， Zo为试验中心点处各参数的真实值， Z为各参数的变化步长，以黄酮提取率为影响值（ Y）。黄酮超临界提取响应面分析试验设计方案与试验结果见表 4
