1、 本科毕业论文 （ 20 届） 食品科学与工程 超临界 CO2 萃取桑叶中黄酮的研究 摘 要 本文研究了 CO2超临界萃取桑叶黄酮的最佳工艺。在单因素试验的基础上，采用三因素三水平的响应曲面分析法，建立桑叶黄酮 CO2超临界流体萃取的二次多项式数学模型，并以桑叶提取率为响应值作响应面，考察萃取压力、萃取温度和萃取时间对药桑黄酮超临界萃取的影响 。实验得到最优化工艺条件：萃取温度为 63.82 ，萃取压强为 256.02bar，萃取时间为 67min。在此提取条件下，桑叶黄酮的理论提取率达 2.7729mg/g。考虑到实际操作的便利，对此条件进行适当修正后进行平行 3次提取验证实验，得到桑叶平均
2、提取率为 2.71mg/g。 关键词 ：桑叶；超临界；响应面；萃取Abstract In this paper, supercritical CO2 extraction conditions of Mulberry. In the single-factor test, based on three factors and three levels using response surface analysis, build Mulberry CO2 supercritical fluid extraction of the quadratic polynomial model, and t
3、he value of mulberry leaves for the extraction rate of response to the response surface, of extraction pressure, extraction temperature and extraction time on drug Sang supercritical fluid extraction of flavonoids. The optimuml experimental conditions: the extraction temperature was 63.82 , extracti
4、on pressure was 256.02bar, extraction time was 67min. In this extraction conditions, extraction rate of the theory of Mulberry was 2.7729mg/g.Taking into account the actual operation of the facilities, which amended the conditions appropriate for parallel extraction of verification experiment 3, the
5、 average extraction rate by mulberry 2.71mg/g. Keywords;mulberry; supercritical; response surface; extractionI 目 录 1 前言 . 1 1.1 桑叶的组成结构、药理功能简介 . 1 1.2 超临界流体萃取的运用现状 . 1 1.3 黄酮类化合物的结构特征和理化特性 . 2 1.3.1 结构特征 . 2 1.3.2 理化特性 . 2 2 仪器与材料 . 2 2.1 实验主要材料 .2 2.2 实验仪器 .2 3 实验方法 . 3 3.1 黄酮含量的测定 .3 3.1.1 标准曲线的绘制
6、 . 3 3.1.2 桑叶提取物中黄酮含量的测定 . 3 3.2 原料的预处理 .4 3.3 萃取步骤 .4 3.4 各因素对实验的单因素实验 .4 3.4.1 温度对黄酮类物质进行单因素提取实验 . 4 3.4.2 压强对黄酮类物质进行单因素提取 . 4 3.4.3 提取时间对黄酮类物质进行单因素提取 . 4 3.5 超临界提取荷叶总黄酮含量的条件优化 .4 4 实验结果 . 4 4.1 单因素影响 .4 4.1.1 萃取温度对萃取率的影响： . 5 4.1.2 萃取压强对桑叶黄酮萃取的影响 . 5 4.1.3 萃取时间对药桑萃取的影响 . 6 4.2 多因素影响 .6 4.2.1 实验数据
7、 . 6 4.2.2 实验数据分析 . 7 II 4.2.3 因数间的交叉影响 . 8 4.2.4 最佳工艺确定 . 9 5 结语 . 10 参考文献 . 11 1 1 前言 1.1 桑叶的组成 结构、药理功能简介 桑叶含有芸香甙、生物碱、糖类、胡萝卜素、多种维生素、叶酸、钙、铁、锌和 17种氨基酸等营养物质和微量元素，桑叶具有抗衰老、降血脂、抑制体内有害细菌繁殖和有害过氧化从理论上讲桑叶茶有抗衰老、降血脂、抑制体内有害细菌繁殖和有害过氧化物生成、防治糖尿病等作用具有滋补肝肾 ,养血祛风 ,生津止渴 ,润肠通便等功效 ,有抗衰老及抗氧化作用 ,补血镇静等医疗功效 ,能选择性地杀伤肿瘤细胞 1。
8、黄酮类化合物是一类低分子量的广泛分布于植物界的天然植物成分，为植物多酚类的代谢物 ,大多有颜色。从植物系统学的角度 ,植物体 产生黄酮的能力与植物体木质化性质密切相关。 1.2 超临界流体萃取的运用现状 超临界流体萃取是近几年来得到较快发展的一种新的提取和分离技术， 也是目前国内外研究的热点。利用流体在超临界状态下，具有良好的近于液体的溶解能力和近于气体的传递性质等十分独特的物理化学性质，提取天然物质的有效成分， 在香料工业、食品工业和医药工业等行业具有广阔的发展前景 2。由于CO2 临界参数低、无毒无害、价廉易得而被广泛用作超临界流体萃取剂 临界流体萃取在食品工业中的应用研究 3。 超临界流
9、体萃取技术已经在西德、美国、英国、法国 、日本和澳大利亚等国开展了多年，尤其是在食品添加剂领域更是取得了丰硕的成果，它的吸引力在于改变溶剂性能而言的灵活性，在特殊情况下的选择性，相分离的快速性和产品不容易被污染的优越性，生产价值高 4。 据报道，国际市场上葛根黄酮含量 40 %的为 300 元 /kg 左右，含量达 80%以上的为 2500 4000 元 /kg，含量 90%以上的为 10000 15000 元 /kg。 是近年来发展起来的一项新型分离技术，它能同时完成萃取和蒸馏两步操作，我们通过对萃取温度、萃取压力、萃取时间等参数进行的CO2 超临界流体萃取桑叶中黄酮的正 交实验，确定了萃取
10、的最佳参数 5。 2 1.3 黄酮类化合物的结构特征和理化特性 图 1 黄酮结构式 Fig 1 flavonoid structure 1.3.1 结构特征 黄酮类化合物是色原烷或色原酮的衍生物。目前泛指由两个芳香环 A和 B通过中央三碳链相互作用连接而成的一系列化合物，其基本骨架具有 C6-C3-C6 的特点天然的黄酮类化合物几乎在 A、 B环上均有取代基，一般是羟基、甲氧基和异戊烯基等。在植物体中，黄酮类化合物因其所在组织不同，其存在状态也呈多样化。在木质部多以苷元形式存在；在花、叶、果实等器宫多以糖甙形式存在。人体包括异黄酮 (Isoflavone)、黄酮 (Flavone)、黄酮醇 (
11、Isoflavono)、黄烷酮 (Flavone)、异黄烷酮 (Isoflavavone)、喳尔酮 (Chalcone)、双氢黄酮、花色甘等 6,7。 1.3.2 理化特性 黄酮类化合物具有较好的水溶性，因其具有酚羟基团 ，故显示一定的酸性，较易溶于碱液中。 2 仪器与材料 2.1 实验主要材料 药桑 亚硝酸钠 氢氧化钠 硝酸铝 CO2 无水乙醇 蒸馏水 2.2 实验仪器 高速万能粉碎机（型号 fw100 天津市泰斯特仪器有限公司）超临界萃取仪（型号 Spe-ed Sfe公司 Applied Separations）紫外可见光光度计（型号 uv-3200pcs上海美谱达仪器有限公司） 3 3
12、实验方法 3.1 黄酮含量的测定 3.1.1 标准曲线的绘制 原理为黄酮化合物与铝盐形成络合物，控制适宜 pH 值，在可见光区获得稳定吸收峰 8。分 别精密称取 对照液 0mL、 1mL、 2mL、 3mL、 4mL、 5mL 和 6mL于 25mL 容量瓶中，分别加无水乙醇补足 6mL 和 5%NaNO2 1mL 混匀后静置6min，再各加 10%A1 (NO3) 31mL，静置 6min 后滴加 10%NaOH10mL，最后加无水乙醇至刻度静置 12 min。由于络合物在 510 nm 处有最大吸收峰，故选此波长。以芦丁对照液浓度 (mgmL-1)为横坐标， 以吸光度为纵坐标，测得标准曲线
13、为 A=11.973C+0.0004， R2=0.99949。 y = 11.973x + 0.0004R2= 0.999400.10.20.30.40.50.60.70 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06芦丁浓度（mg/ml）吸光度（A）图 2 芦丁标准曲线 Fig2 Standard curve of rutin 3.1.2 桑叶提取物中黄酮含量的测定 方法为将 10ml 酒精定容于含有提取物的棕色瓶子，并用超声装置超声以便提取物完全溶解，用吸管吸取 1mL 提取液于 25mL 容量瓶中， 各加无水乙醇至6mL 和 5%NaNO21mL 混匀后静置 6min,再各加
14、 10%A1(NO3)31mL,静置 6min 后滴加 10%NaOH10 mL,最后加无水乙醇至刻度静置 12 min，同样的方法配制一瓶不加提取液的对照组。由于络合物在 510 nm处有最大吸收峰 ,故选此波长。 桑叶 黄酮得率 = W VaY 式中 Y 由回归方程计算出的黄酮浓度， mg/mL； 4 a 稀释体积 倍数 ； V 提取液体积， mL； W 桑叶粉末质量， g10。 3.2 原料的预处理 将桑叶在 105 烘箱中烘干，粉碎，过 80目筛，放置于干燥器中，备用。 3.3 萃取步骤 称取粉碎后的桑叶 2g 置于超临界萃取釜中，按工艺要求调节好萃取温度 、压强、 CO2 流量 。
15、待制冷系统和萃取温度 达到后，先进行 CO2 静态浸泡 10 分钟，然后 开动高压泵进行循环萃取操作，在此过程中保 持二氧化碳流量稳定，到达 所需时间后，结束萃取。 萃取物用 10mL 无水乙醇超声溶解，定容。 3.4 各因素对实验的单因素实验 3.4.1 温度对黄酮类物质进行单因素提取实验 准确称取 2.0g 桑叶粉末用棉花分三层装入提取管，将提取管与超临界装置连接，进行萃取，所有提取过程都先静态提取 15min。固定压强 225bar， 固定时间 60min， 分别对温度（ 40 ， 50 ， 60 ， 70 ， 80 ）进行提取并用棕色瓶储存，考察温度对荷叶黄酮类物质提取效果的影响。 3
16、.4.2 压强对黄酮类物质进行单因素提取 提取方法同 3.4.1。提取温度为 60 ，提 取时间为 45min，压强为（ 150bar，200bar， 250bar， 300bar， 350bar）进行超临界提取并用棕色瓶储存，考察压强对桑叶黄酮类物质提取效果的影响。 3.4.3 提取时间对黄酮类物质进行单因素提取 提取方法同 3.4.1。提取温度为 60 ，提取压强为 225bar，时间为（ 30min，55min, 80min， 105min, 130min）条件下分别进行提取并用棕色瓶储存，考察提取时间对桑叶黄酮类物质提取效果的影响。 3.5 超临界提取荷叶总黄酮含量的条件优化 通过以上
17、的单因素实验，选取对样 品黄酮类物质提取影响进行综合评价确定了 三个因素作三因素三水平的响应面实验 ， 对提取条件作进一步优化 。 4 实验结果 4.1 单因素影响 5 4.1.1 萃取温度对萃取率的影响 00. 050. 10. 150. 20. 250. 330 40 50 60 70 80 90萃取温度（）吸光度（A）图 3 萃取温度对吸光度的影响 Fig3 the impact of extraction temperature on the absorbance 保持萃取压强为 250bar，萃取时间 45min，温度为 40 ， 50 ， 60 ， 70 ，80 。 考察温度对药桑黄酮萃取的反映，从图 1中可以看出 在 60 以前变化很大随温度的改变， 60 以后变化不大。 4.1.2 萃取压强对桑叶黄酮萃取的影响 00. 050. 10. 150. 20. 250. 3100 150 200 250 300 350 400萃取压强（ ba r ）吸光度（A）图 4 萃取压强对吸光度的影响 Fig4 extraction pressure on the absorbance 保持温度在 60 ，萃取时间为 45min，压强 (150bar， 200bar， 250bar， 300bar，
