1、 本科毕业论文 （ 20 届） 食品科学与工程 荷叶总黄酮的超声提取工艺参数研究 摘 要 荷叶黄酮的乙醇提取工艺受到许多因素的影响， 各因素间还存在着交互作用，本实验通过单因素， Box-Behnken 设计和响应面分析法，研究了超声乙醇提取荷叶黄酮的工艺参数。以荷叶黄酮的得率为指标，通过单因素试验确定了荷叶超声提取黄酮的超声功率，超声温度，料液比，乙醇浓度，同时通过 Box-Behnken 设计和响应面分析法确定了最佳提取条件。单因素试验表明荷叶黄酮提取的最适乙醇浓度为 60%，最适 超声温度为 70，最适超声功率为 200W，最适料液比为 1：20，另外，通 过 Design expert
2、 6.0软件设计响应面优化法得到的最佳提取条件 为：乙醇浓度 60%，超声功率 200W，超声温度 70，在此优化提取条件下得到的黄酮提取得率为 0.534%，极大提高黄酮的提取得率，为工业化利用丰富的荷叶资源，提取总黄酮提供了生产数据和技术基础。 关键词： 黄酮 超声提取 工艺参数 单因素 响应面优化 ABSTRACT This study investigated the technological parameter of ultrasound extraction of flavonoids from the lotus leaves with the single factor an
3、d Box-Behnken orthogonal design experiment. The results showed that, ultrasonic extraction power , ultrasonic extraction temperture, ethanol concentration, the ratio of solvent to material were main factors to affect the extraction rate of flavonoids. The optimum parameters was as follow: ultrasonic
4、 extraction power was 200W, ultrasonic extraction temperature was 70 , ethanol concentration was 50%. Key words: flavonoids, ultrasound extraction, technological parameter I 目 录 1 前言 . 1 2 材料与方法 . 2 2.1 实验材料 . 2 2.1.1 试剂 . 2 2.1.2 仪器 . 2 2.2 方法 . 2 2.2.1 标准曲线的制作 . 2 2.2.2 荷叶总黄酮的提取 . 2 2.2.3 试验设计 . 3
5、 3 结果与分析 . 4 3.1 单因素分析 . 4 3.1.1 超声温度对荷叶黄酮得率的影响 . 4 3.1.2 乙醇浓度对荷叶黄酮 得率的影响 . 5 3.1.3 超声功率对荷叶黄酮得率的影响 . 5 3.1.4 料液比对荷叶黄酮得率的影响 . 6 3.2 响应面分析 . 6 3.2.1 Box-Behnken 设计方案及结果 . 6 3.2.2 响应面和等高线分析 . 8 3.2.2 荷叶总黄酮提取工艺的确定 . 10 3.2.3 最佳工艺的验证 . 10 4 结论 . 10 1 1 前言 荷叶为睡莲科植物莲 (Nelumbo nuficera Gaertn)的叶，又名莲叶，藕叶，多年生
6、水生植物，是被子植物中起源最早的种属之一。荷叶味苦，性平，归 肝、脾、胃，具有清暑利湿、升发清阳、清心去热、止血利水的功效 1-3。 荷叶化学成分复杂，含有生物碱、黄酮、精油、靴质、维生素 C、酒石酸、构椽酸、苹果酸、草酸等，其中黄酮类化合物的生物活性较高，因而近年来人们加大了对黄酮类化合物的研究 4,5。 研究表明，荷叶黄酮具有明显的降低血清胆固醇、降低 3-羟基 -3-甲基戊二酸单酰辅酶 A(3-hydroxy-3-methylguta-rylcoenzyme A， HMG CoA)还原酶、降低血清甘油三酯和升高血清高密度脂蛋白胆固醇 (high density lipoprotein c
7、holesterol， HDL-C)、提高肝脂酶 (Hepatic Lipase， HL)及血清脂蛋白脂酶(Lipoprotein Ijpase， LPL)活力的作用 6-10。叶德强等 11以新西兰兔为动物模型研究黄酮对胆囊胆固醇结石形成的影响和机制，结果表明：荷叶黄酮具有降低肝脏氨肽酶 N(Aminopeptidase N ， APN) 的表达、降低血清亮氨酸氨肽酶(1eucineaminopeptidase， LAP)的活性和预防胆囊胆固醇结石形成的作用。 Yuka等 12研究表明荷叶提取物具有缓 解消化不良、抑止脂类和糖类吸收以及加速脂质代谢和能量消耗的作用，从而可以达到降脂减肥的目的
8、。荷叶黄酮具有抗衰老作用，荷叶黄酮主要通过提高抗氧化酶活性，清除或减少氧自由基和脂质过氧化物而实现其抗衰老作用 13。陈海光等 14研究表明荷叶水提物对羟基自由基 (OH)和超氧阴离子自由基 (O2) 有很强的清除能力， 26.94gml-1 的水提物对次黄嘌呤 -黄嘌呤氧化酶体系产生的 O2清除率达 65.60，水提物浓度大于 8.98 mgml-1时，可以全部清除由 Fenton 反应体系产生的 OH。 目前常用于荷叶 总黄酮的提取分离方法有以下几种 :水提取法、乙醇 /水溶剂提取法、超声波提取法，大孔树脂吸附分离法、乙醇 /水溶液加微波和树脂提取分离法。 本实验主要通过 单因素试验确定荷
9、叶超声提取黄酮的超声功率，超声温度，料液比，乙醇浓度，并在此基础上， 利用 Design expert 软件 Box-Behnken 设计和响应面分析法确定荷叶黄酮最佳提取条件。 2 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 试剂 荷叶，经过干燥脱水后成荷叶粗品：芦丁 (Rutinu)生化试剂，国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、无水乙醇、亚硝酸钠、硝 酸铝均为分析纯。 2.1.2 仪器 UV-160A紫外可见分光光度计 (日本岛津公司 )； E52CS旋转蒸发仪 (上海荣生仪器厂 )；粉碎机 (江阴市伟翔药化机械厂 )； KQ5200B型超声波清洗器 (昆山超声仪器有限公司 )；电子天平
10、（日本 A&D公司）水浴锅等。 2.2 方法 2.2.1 标准曲线的制作 配制 质量浓度为 0.4mg/mL 的芦丁标准液。分别取上述芦丁标准液 0， 0.2，0.4， 0.6， 0.8， 1.0ml置于 25mL的容量瓶中，用 70%的乙醇溶液稀释到 10mL，加入 017mL 5%的 NaNO2溶液，摇匀，静置 5min，再加入 0.17mL 10%Al (NO3)3溶液 ,摇匀，静置 5min，再加入 5mL 1mol /L的 NaOH溶液，用 70%的乙醇溶液定容至25mL, 混匀放置 5min后，分别在 310nm、 410nm、 510nm处测定其吸光值，取最优值作为最终吸光度值。
11、 以吸光度 A为纵坐标 ， 芦丁标准液浓度 C为横坐标 ， 绘制标准曲线 (图 1)。 y = 1 . 5 2 3 6 x - 0 . 0 1 4 7R2= 0 . 9 9 6 9-0 . 100 . 10 . 20 . 30 . 40 . 50 . 60 . 70 0 . 1 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 . 5浓度（ m g / m l ）吸光度A图 1 芦丁标准曲线 Fig.1 standard curve of Rutin 2.2.2 荷叶总黄酮的提取 3 从干燥 后的荷叶粉，取 0.5 g 荷叶粉放入具塞三角瓶中按一定的液固比加入乙醇水溶液，超声提取一段时间后，趁热过滤。重
12、复提取后合并滤液。将提取液浓缩至 30 mL 左右，高速离心 20 min 后经微孔滤膜过滤，用 60 %乙醇定容。用制作标准曲线同样的方法，测定其黄酮类化合物的含量。 荷叶黄酮得率 = W VaY 100% 式中 Y 由标准曲线计算出的黄酮浓度， mg/mL； a 稀释体积； V 提取液体积， mL； W 荷叶粉末质量， g。 2.2.3 试验设计 2.2.3.1荷叶黄酮提取的单因素试验 试验对超声温度，乙醇浓度、液固比、超声功率进行单因素探索试验，分别考察这 4个因素对黄酮收率的影响。具体处理如下： （ 1） 超声温度的对荷叶黄酮得率的影响 选用 60的乙醇提取荷叶黄酮，料液比 1： 40
13、，超声功率为 200W，超声温度分别选用 50， 60， 70， 80， 90，超声提取 3min，每超声 3s间隔 3s，按2.2.2方法测定总黄酮得率，根据测定结果选择总黄酮得率最高时的超声温度。 （ 1）乙醇浓度的选择 分别选用 40、 50、 60、 70、 80和 90的乙醇提取荷叶总黄酮，超声温度为： 70，超声功率为 200W. 在液固比为 40： 1的条件下超声提取 3min，每超声 3s间隔 3s，按方法 2.2.2分别测定其总黄酮提取率，根据测定结果选择总黄酮提取率最高时的乙醇浓度。 （ 2）超声功率的选择 选用 60的乙醇提取荷叶黄酮，在液固比为 40： 1的条件下，超声
14、温度为 70，超声功率分别选择 100W， 150W， 200W， 250W， 300W，超声提取 3min，每超声 3s间隔 3s，按方法 2.2.2分别测定其总黄酮得率，根据测定结果选择总黄酮得率最高时的超声功率。 （ 3）液固比的选择 选用 60的乙醇提取荷叶黄酮，分别在料液比为 1： 20、 1： 30、 1： 40、 1：4 50、 1： 60的条件下超声提取 3min，每超声 3s间隔 3s，超声温度为 70，超声功率为 200W，按方法 2.2.2分别测定其总黄酮得率，根据测定结果选择总黄酮得率最高时的料液比。 2.2.3.2 响应面法优化荷叶黄酮提取工艺条件 Box-Behnk
15、en 设计 为了分析各因素之间的交互作用对结果的影响，分析参数影响因素，得到最佳的提取工艺，试验在单因素试验结果的基础上，提取次数确定为两次，采用Box-Behnken 设计，以荷叶黄酮的提取率为考察目标，分别以超声温度、超声功率、乙醇浓度对应三个独立变量 A、 B、 C，中心点处理 3次，其他处理 1次。试验的试验因素水平编码见表 1。 表 1 Box-Behnken因素水平表 Table 1 The table of Box-Behnken factors 水平 超声温度 超声功率 W 乙醇浓度 % 1 60 150 40 0 70 200 50 -1 80 250 60 3 结果与分析
16、3.1 单因素分析 3.1.1 超声温度对荷叶黄酮得率的影响 在料液比 1： 40，超 声功率为 200W，乙醇浓度为 60%条件下，荷叶总黄酮得率与超声温度的关系见图 2 图 2 温度对荷叶黄酮浓度的影响 Fig. 2 Effects of different extracting temperatures on flavonoid contents 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 50 60 70 80 90 温度（） 荷叶黄酮浓度（mg/mL）5 由图 2可知，超声温度 70之前，荷叶总黄酮得率随着温度的升高而增大，当超声温度高于 70时，荷叶总黄酮得率随着温度的升
17、高而呈减少的趋势。这说明温度过低或者过高都会影响荷叶总黄酮提取，当超声 温度为 70时，荷叶总黄酮得率最高，故我们选择超声温度为 70。 3.1.2 乙醇浓度对荷叶黄酮得率的影响 在料液比 1： 40，超声功率为 200W，超声温度为 70条件下，荷叶总黄酮得率与乙醇浓度的关系见图 3. 图 3 乙醇浓度对荷叶黄酮浓度的影响 Fig. 3 Effects of different ethanol concetrations on flavonoid contents 从图 3中可知，随着乙醇浓度从 30增加到 60，荷叶总黄 酮提取率呈上升趋势，但是当乙醇浓度超过 70，荷叶总黄酮提取率则随着
18、浓度的增大而降低。这说明当乙醇浓度过低或过高时都会降低荷叶总黄酮的提取率；当乙醇浓度达到60时，荷叶总黄酮提取率最高。因此，本实验选择 60的乙醇作为提取溶剂。 3.1.3 超声功率对荷叶黄酮得率的影响 乙醇浓度为 60%，在料液比 1： 40，超声温度为 70条件下，荷叶总黄酮得率与超声功率的关系见图 4. 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2 0.22 0.24 0.26 0.28 30 40 50 60 70 乙醇浓度（ % ） 荷叶黄酮浓度（mg/mL）6 图 4 超声功率对荷叶黄酮浓度的影响 Fig.4 Effects of different ultrasonic
19、 extraction power on flavonoid contents 从图 4可以得出，随着超声功率从 100W增加到 200W时，荷叶总黄酮得率随着超声功率的增大而增大，但当超声功率从 200W增加到 300W时，荷叶总黄酮得率随着超声功率的增大而减少，说明超声功率过高会影响荷叶总黄酮提取，超声功率为 200W时，荷叶总黄酮得率最高。因此，我们实验超声功率选用 200W。 3.1.4 料液比对荷叶黄酮得率的影响 乙醇浓度为 60%，超声功率为 200W，超声温度为 70条件下，荷 叶总黄酮得率与液料比的关系见图 5. 图 5 液料比对荷叶黄酮浓度的影响 Fig. 5 Effects
20、 of different solid-liquid ratios on flavonoid contents 从图 5可以得出，荷叶总黄酮得率随着料液比的增加而呈现下降的趋势，说明料液比过高，直接影响荷叶内总黄酮的提取。 3.2 响应面分析 3.2.1 Box-Behnken设计方案及结果 按方法 2.2.3.2得到的 Box-Behnken设计方案及 响应值见表 2。 0 0.1 0.2 0.3 0.4 100 150 200 250 300 超声功率（ W ） 荷叶黄酮浓度（mg/mL）0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 20 30 40 50 60 液料比 荷叶黄酮浓度（mg/mL）
