1、 本科毕业论文 （ 20 届） 食品科学与工程 扇贝蛋白质酶法水解条件的优化 摘 要 本研究对扇贝肉酶法水解工艺进行了优化。首先建立了扇贝肉中蛋白质含量和 pH- stat 法 水解度测量方法。通过比较从 4 种不同蛋白酶中选取碱性蛋白酶进行酶解条件研究， 通过单因素试验确定了 碱性 蛋白酶的反应条件：底物蛋白浓度7g/100mL、反应温度 65 、 pH8.0、反应时间 210min、酶用量 0.048 AU/g 蛋白。选取酶用量、 pH 值、反应时间作为变量，通过 正交试验 得出影响程度顺序为：酶用量、 pH 值、反应时间，三个因 素间交互作用不显著。 关键词 ：扇贝；蛋白酶；水解；条件优
2、化 ABSTRACT Optimization of escallop meat enzymatic hydrolysis was studied. Methods to measure the scallop meat protein content and the hydrolysis degree with peptide as target product were established. Through comparing four different proteases, a alkali protease, were selected for more researching.
3、 By single factor experiment, optimal conditions for protease reaction was established: substrates protein concentration 7g / 100mL, reaction temperature 65 , reaction pH 8.0, reaction time 210min, enzyme dosage 0.048 AU/g protein. Enzyme dosage, pH value, reaction time were selected as variables, b
4、y orthogonal experiment, concluded the influence degree order: enzyme dosage, pH value, reaction time. There wast significant interaction within three factors. Key words: Scallop; Protease; Hydrolysis; Optimal conditions I 目 录 1 前言 . 1 1.1 扇贝的产量和加工方向 . 1 1.2 蛋白水解原理和机制 . 1 1.3 蛋白水解产物的价值 . 2 2 材料和方法 .
5、 2 2.1 实验材料 . 2 2.1.1 材料与试剂 . 2 2.1.2 仪器 . 3 2.2 方法 . 3 2.2.1 扇贝肉中蛋白质浓度的测定 . 3 2.2.2 水解度的确定 . 3 2.2.3 不同蛋白酶水解试验 . 4 2.2.4 碱性蛋白酶单因素试验 . 4 2.2.5 碱性蛋白酶多因素正交试验 . 5 3 结果与分析 . 6 3.1 扇 贝肉中蛋白质浓度的测定 . 6 3.2 水解度测定方法的选择 . 6 3.3 不同蛋白酶的选择 . 7 3.4 碱性蛋白酶单因素试验 . 8 3.4.1 温度 对水解度的影响 . 8 3.4.2 反应时间 对水解度的影响 . 8 3.4.3 p
6、H 值 对水解度的影响 . 9 3.4.4 固液比 对水解度的影响 . 10 3.4.5 酶用量 对水解度的影响 . 10 3.5 正交试验 . 11 4 结论 . 12 参考文献 . 13 1 1 前言 1.1 扇贝的产量和加工方向 扇贝 （ escallop） 是扇贝属的双壳类软体动物的代称，约有 400 余种。该科的 60 余种是世界各地重要的海洋渔业资源之一，壳、肉、珍珠层具有极高的利用价值。扇贝是我国沿海主要养殖贝类之一，常见的扇贝养殖种类有栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝 1。扇贝加工过程中，人们把扇贝闭壳肌加工为扇贝柱，也称 “干贝 ”，而俗称为 “扇贝边 ”的其余的软体部分因感官性
7、状稍差、加工和保存困难等因素，多作为饲料甚至丢弃。近年来研究发现扇贝边中含 有大量营养成分，是一种极具加工潜力的海洋资源 2。利用扇贝肉或扇贝边加工水解动物蛋白（ HAP）是一种具有显著经济效益和社会效益的利用方法。水解动物蛋白是以动物组织为原料经水解工艺获得的产品，同水解植物蛋白相比，具有氨基酸含量高、氨基酸种类平衡和营养价值高的特点。水解动物蛋白、水解植物蛋白、酵母抽提物、核苷酸被认为是食品调味剂行业的主要发展方向。除用于食品调味剂以外，水解蛋白还可作为营养补充剂以及提取功能性成分等。目前在水解蛋白生产中，多使用盐酸作为水解剂，在高温环境中完成水解，具有成本低廉、简单易行、水解 率高的优点
8、，但同时存在水解度不易控制、营养成分损失、感官品质较差、安全性差等缺点，特别是极易产生致癌物质氯丙醇，限制了酸水解方法在食品工业中的应用。使用蛋白酶作为水解剂则具有条件温和、安全性高、营养损失少、功能性成分含量高的优点，但在水解速度和程度上不如酸水解方法 3。随着人们对食品安全和环境污染问题的重视，安全性高、环境友好的蛋白酶解方法成为最佳选择。 1.2 蛋白水解原理和机制 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其水解肽键的方式，可以将其分为内切酶和外切酶两类。内切酶将蛋白质分子内部切断，形成分 子量较小的多肽。外切酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，产生游离氨基酸，分别称为氨
9、肽酶和羧肽酶。按其活性中心的氨基酸组成和反应机理，可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反应的最适 pH 值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。 不同类型、不同来源的蛋白酶在底物特异性、最适温度、 pH、金属离子影2 响等因素具有较大的差别，因此应用于生产时应根据使用环境和目的选择特定蛋白酶种类。 1.3 蛋白水解产物的价值 长期以来，人们认为分子量更小的氨基酸在吸收速度和利用程度 上具有优势，但近年来的很多研究表明 5、 6，肽具有更好的吸收速度并具有氨基酸不具备的功能性。肠道对氨基酸的吸收依赖与不同的氨基酸转运蛋白，具有竞争性和易饱和性，吸收过程依赖
10、于跨膜 Na+浓度梯度，能量消耗大。肽的转运蛋白无竞争性，不易饱和，依赖跨膜 H+浓度梯度，能量消耗低。在动物实验中，通过口服途径给予肽和氨基酸，肽处理组的血液氨基酸水平的变化时间更短，变化程度更大，表明肽的吸收效率和利用程度更好。肽还具有众多生理功能，目前研究的热点包括治疗高血压的血管紧张素转换酶抑制肽（ ACEI Peptide）、抗氧化 肽、抗菌肽、抗肥胖肽、抗过敏肽、风味肽等，涵盖众多功能应用方向 7。综合考虑蛋白酶解程度和应用价值，选择肽作为蛋白水解的目标产物。 2 材料和方法 2.1 实验材料 2.1.1 材料与试剂 新鲜扇贝肉：购自宁波市大世界水产市场 ， -18 冷冻保存备用。
11、 碱性蛋白酶：最适作用条件： 5570 ， pH6.58.5（具体条件取决于底物类型）。标定活力 2.4AU/g。 中性蛋白酶：最适作用条件： 4555 ， pH5.57.5。 标定活力 0.5AU/g。 复合蛋白酶：最适工作条件： 3560 ， pH5.57.5。 标定活力 1.5AU/g。 酸性 蛋白酶：最适工作条件： 3540 ， pH1.52.0。标定活力 3.0AU/g。 本研究使用的其他药品见表 1 表 1 主要药品和来源 Table1 Main drugs and source 名称 来源 级别 NaOH 国药集团化学试剂有限公司 分析纯 H2SO4 国药集团化学试剂有限公司 分
12、析纯 CuSO4 国药集团化学试剂有限公司 分析纯 3 K2SO4 国药集团化学试剂有限公司 分析纯 NaCl 国药集团化学试剂有限公司 分析纯 HCl 国药集团化学试剂有限公司 分析纯 三氯乙酸 国药集团化学试剂有限公司 分析纯 2.1.2 仪器 本研究主要使用的仪器和设备见表 2。 表 2 主要设备及型号 Table2 Main equipments and models 设备名称 型号 来源 夹套式循环冷却粉碎机 SK-M10R 日本协立理工株式会社 全自动凯氏定氮仪 UDK152 意大利 电子分析天平 SR8001 METTLER TOLEDO pH 计 F-23 HORIBA 电热恒
13、温水浴锅 BK-43 YAMATO 紫外可见分光光度计 756MC 上海分 析仪器厂 高速冷冻离心机 GL-20B 上海安亭科学仪器厂 2.2 方法 2.2.1 扇贝肉中蛋白质浓度的测定 冷冻保存的扇贝肉使用粉碎机粉碎为浆状，按固液比 1:4 与生理盐水混合后在 4 下浸泡 30min，期间搅拌数次， 4000rpm 离心 10min， 倒去上清液后 取沉淀 后续试验用材料， -18 冷冻保存。 使用凯氏定氮法测定蛋白质含量，具体操作为：精密称取待测样品 0.10.3g 于消化管中，加入 10mL 浓硫酸， 0.3g K2SO4，0.03g CuSO4，置于消化装置上消化，先在 250 下消化
14、 1h，直至无碳粒 溅出，然后逐渐升温至 500 消化至淡蓝色至淡绿色透明液体，然后用 UDK152 凯氏定氮仪蒸馏并滴定，计算扇贝肉中蛋白质含量。 2.2.2 水解度的确定 采用 pH- stat14法测定 水解度 。 水解开始时 , 用 pH 试纸测定体系的 pH 值 ,4 反应结束后测定反应体系的 pH 值 , 用 0.2mol/L 的 NaOH 将反应体系的 pH 调到原来的 pH, 记录下所用的碱液的量 , 按下式即可计算出各蛋白的水解度 : 水解度 D H % = B (M b) (1/) (1/ M P) (1/h tot)100 其中 : B 为 NaOH 的体积 (mL )
15、; M b 为 NaOH 的浓度 (mol/L ) ; M P 为蛋白质的质量 (g) ; h tot 为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数 , 对于本文中几种蛋白酶 , 该值取 8.2。 2.2.3 不同蛋白酶水解试验 底物蛋白质浓度为 5g/100mL，使用 HCl、 NaOH 调节 pH。碱性蛋白酶水解条件：酶用量为 0.048AU/g 蛋白，酶解温度 60 ， pH8.0，反应时间 4h。中性蛋白酶水解条件：酶用量为 0.020AU/g 蛋白，酶解温度 50 ， pH7.0，反应时间 4h。复合蛋白酶水解条件：酶用量为 0.060AU/g 蛋白，酶解温度 50 ， pH7.0，反应时间 4
16、h。 酸性 蛋白酶水解条件：酶用量为 0.012AU/g 蛋白，酶解温度 40 ， pH2.0，反应时间 4h。反应结束后沸水浴 10min， 用 0.2mol/L 的 NaOH 滴定 ， 按 2.2.2 测定水解度。 2.2.4 碱性蛋白酶单因素试验 2.2.4.1 温度 对水解度的影响 底物蛋白质浓度为 5g/100mL，体系 pH8.0，酶用量 0.048AU/g 蛋白，反应时间 4h。反应温度分别为 50 、 55 、 60 、 65 、 70 、 75 、 80 。反应结束后沸水浴 10min， 用 0.2mol/L的 NaOH 滴定 ，按 2.2.2 测定水解度。 2.2.4.2
17、反应 时间 对水解度的影响 底物蛋白浓度为 5g/100mL，体系 pH8.0，酶用量 0.048 AU/g 蛋白，反应温度 65 。反应时间分别为 30min、 60min、 90min、 120min、 150min、 180min、210min、 240min。反应结束后沸水浴 10min， 用 0.2mol/L的 NaOH 滴定 ，按 2.2.2测定水解度。 2.2.4.3 pH 对水解度的影响 底物蛋白浓度为 5g/100mL，酶用量 0.048 AU/g 蛋白，反应温度 65 ，反应时 间 210min。使用固体 NaOH 调节分别体系 pH 为 6.5、 7.0、 7.5、 8.
18、0、 8.5。反应结束后沸水浴 10min， 用 0.2mol/L的 NaOH 滴定 ，按 2.2.2 测定水解度。 2.2.4.4 固液比 对水解度的影响 酶用量 0.048 AU/g 蛋白，反应温度 65 ，反应时间 210min，体系 pH8.0。5 底物蛋白浓度（ g/100mL）分别为 4、 5、 6、 7、 8、 9。反应结束后沸水浴 10min，用 0.2mol/L的 NaOH 滴定 ，按 2.2.2 测定水解度。 2.2.4.5 酶用量 对水解度的影响 底物蛋白浓度为 7g/100mL，体系 pH8.0，反应温度 60 ，反应时间 210min。酶用量（ AU/g）分别为 0.
19、024、 0.036、 0.048、 0.060、 0.072。反应结束后沸水浴10min， 用 0.2mol/L的 NaOH 滴定 ，按 2.2.2 测定水解度。 2.2.5 碱性蛋白酶多因素正交试验 通过单一因素试验，确定酶用量、 pH 值、反应时间三个因素的三个水平，以水解度为评价指标，选用 Lg(33)正交表安排试验，因素水平表见表 3，试验安排表见表 4。其他反应条件为底物蛋白质浓度 7g/100mL，反应温度 60 。反应结束后沸水浴 10min， 用 0.2mol/L的 NaOH 滴定 ，按 2.2.2 测定水解度。 表 3 碱性蛋白酶正交试验因素水平表 Table 3 Fact
20、ors and levels of orthogonal experiment for alkali protease 水平 因素 A 酶用量（ AU/g 蛋白） 因素 B pH 值 因素 C 反应时间（ min） 1 0.036 7.5 180 2 0.048 8.0 210 3 0.060 8.5 240 表 4 碱性蛋白酶正交试验安排表 Table 4 Orthogonal test schedule for alkali protease 试验号 因素 A 因素 B 因素 C 空列 1 1（ 0.036） 1（ 7.5） 1（ 180） 1 2 1（ 0.036） 2（ 8.0） 2（
21、 210） 2 3 1（ 0.036） 3（ 8.5） 3（ 240） 3 4 2（ 0.048） 1（ 7.5） 2（ 210） 3 5 2（ 0.048） 2（ 8.0） 3（ 240） 1 6 2（ 0.048） 3（ 8.5） 1（ 180） 2 7 3（ 0.060） 1（ 7.5） 1（ 180） 2 6 8 3（ 0.060） 2（ 8.0） 3（ 240） 3 9 3（ 0.060） 3（ 8.5） 2（ 210） 1 3 结果与分析 3.1 扇贝肉中蛋白质浓度的测定 研究资料表明，牡蛎、扇贝等软体动物中含氮化合物并否都以蛋白质形式存在，尚存在一部分以游离氨基酸、氨、胺类、肌酸
22、、牛磺酸、甜菜碱等小分子含氮化合物，蛋白质态氮仅占总氮的 75%左右 8。凯氏定氮法的原理为利用浓硫酸在高温条件下将材料中全部氮元素转化为硫酸铵形式，调节 pH 至强碱性并加热使氨挥发出来，被硫酸吸收后通过酸碱滴定确定氨的量并进而推算出含氮量及蛋白质含量 。凯氏定氮法测量蛋白质的前提假设为食品中所有氮元素均存在于蛋白质中，对于富含非蛋白质态氮的软体动物而言，该方法并非完全合适。考虑到非蛋白质态氮多以水溶性小分子形式存在，本研究中采用浸泡的方法除去扇贝肉中小分子可溶性非蛋白氮，按固液比 1:4 与生理盐水混合后在 4 下浸泡 30min，离心取沉淀作为供试材料。 用凯氏定氮法测量蛋白质含量，结果
23、为 13.75%（ W/W）。 有研究称软体动物体内存在组织蛋白酶，在特定条件下可快速分解组织蛋白质 6。为减少自身组织蛋白酶对试验结果的影响，离心获得的供试材料置于 -18下冷冻 保存以减少自身蛋白质的分解。 3.2 水解度测定方法的选择 常见的蛋白质水解度的测定方法有三硝基苯磺酸法 (TNBS) , 甲醛固定法 ， 茚三酮法 , 三氯乙酸法和 pH- stat 法 。 在上述几种方法中 , 国内通常采用甲醛固定法和茚三酮法。对于茚三酮法 , 由于比色测定时读数不稳定 , 很难读出一个准确的数值 ; 而且它采用单一氨基酸作为标准 , 而不同的氨基酸对茚三酮的显色度有偏差 , 因此所得的结果不够准确。甲醛固定法操作相对简单 , 但结果偏低。对于 TNBS 法 , 测定结果相对可靠 , 但测定用试剂不容易买到 。本文采用一种实用简便的 pH- stat 法 ，它不同于经典的 pH- stat 法 对反应体系的 pH值进行在线控制，而是用 0.2mol/L 的 NaOH 对反应体系的终点进行滴定，通过0.2mol/LNaOH 的用量计算出水解度 。
