1、 i 本科毕业论文 （ 20 届） 食品科学与工程 水解猪血红蛋白制备肉味香精的研究 摘 要 本文利用屠宰场的副产品猪血中的血红蛋白的酶解液作为反应基料，通过以ii Maillard 反应为主的系列反应来制备热反应型肉味香精。首先，在新鲜猪血离心后得到的血红蛋白中加入酶，在适当的温度、 pH 条件下反应得到猪血水解液。然后，在水解液中加入葡萄糖、硫胺素、牛磺酸、 L-cys 以及抗坏血酸，控制反应温度、时间和 pH，通过两水平因素实验，筛选出用猪血水解液制备肉味香精的最主要的三个因素。最后，用响应面分析 法对制备肉味香精的反应条件进行设计和优化，结合感官评定对不同制备工艺条件下的肉味香精进行分
2、析。结果显示最佳配方及工艺条件为：猪血水解液 38%，葡萄糖 15%，硫胺素 1.5%，牛磺酸3%， L-cys2.5%，反应时间 45min，反应温度 98.3 ，起始 pH 为 7.5。在此条件下获得的产品风味最好。 关键词 ：猪血水解液； 肉味香精； 美拉德反应； 感官分析； ABSTRACT The objective of this research was to prepar meat flavor using the hydrolyzate of iii pig haemoglobin an outgrowth come from slaughterhouse by a seri
3、es of reaction,mainly Maillard reaction. Firstly, after haemoglobin was centrifugaled from pig blood, enzyme was added on appropriate degree. Hydrolysis was carried out at optimum conditions of temperature, initial pH . Secondly, on the basis of the products obtained above, the formula of product wa
4、s improved by adding of glucose, thiamin, taurine, cysteine and ascorbic acid. Similarly, the reaction temperature, initial pH, and reaction time should be controlled in Maillard reaction. Then, a Plackett-Burman design combined with sensory valuation were used to evaluate the most influence of rela
5、ted factors. Finally, the Box-Behnken design and sensory analysis were used to determine the optimal levels of the main factors. The optimal formula and processing condition were obtained as follow: pig haemoglobin 38%, glucose 15%, thiamin 1.5%, taurine 3%, cysteine 2.5%as the reactant, reaction te
6、mperature 98.3 , reaction time 45min, initial pH 7.5. By sensory evaluation, the best flavor of product was obtained under such condition. Key words： Pig haemoglobin; Maillard reaction; Meat flavor; Sensory valuation; I 目 录 1 前言 .1 2材料与方法 . 2 2.1 实验材料 . 2 2.1.1 仪器 . 2 2.1.2 药品材料 . 2 2.2 实验 方法 . 3 2.
7、2.1 猪血红蛋白酶解液的制备 . 3 2.2.2 肉味香精制备的方法 . 3 2.2.3 肉味香精的工艺优化试验 . 3 2.2.3.1 两水平因 素试验 . 3 2.2.3.2 感官 评定 方法 . 4 2.2.3.3 响应面试验 . 4 3结果与分析 . 5 3.1 两水平因素 试 验所得产物的感官分析结果 . .5 3.1.1Plackett-Burman 设计筛选重要因素 5 3.1.2方差分析表 . 6 3.2 响应面 试 验的结果 . 6 3.2.1 响应面分析法确定最佳阈值 . 7 3.2.2 实验因素水平及编码 . .7 3.2.3 回归模型的建立及方差分析 . 7 3.2.
8、4 二次回归方程分析及响应面 . 8 3.2.5最佳工艺 验证 . 10 4结论 . 10 1 1前言 肉类香精泛指具有肉类 风味的一类食品添加剂，这类添加剂广泛应用于肉类加工食品和方便食品 1 。添加适当的肉类香精不仅可以补充原有食品香气的不足，还可以减少肉类提取物的加入，降低食品成本。目前肉类香精通常分为天然肉类香精与合成肉类香精两大类 2，而其中天然肉类香精的生产促进了合成肉类香精（尤其是热反应型肉类香精）的发展。而本实验旨在研究利用猪血作为原材料来制备肉味香精。 大家对猪血都并不陌生，它的营养价值丰富，蛋白质含量接近 18%，高于鸡蛋。不仅如此，猪血中还含有很多功能型蛋白，如血清中的白
9、蛋白、凝血酶原、纤维蛋白和红血球中的 血红素、超氧化歧化酶等，这些物质皆可应用于医药、食品、化妆品等领域 3。有研究表明， 100g 猪血中铁的含量高达 40mg 以上，且多以 结合铁的形式存在 4。在我国，猪血资源可谓相当丰富，每年屠宰厂可得猪血总量约为 10 亿公斤 5。然而大部分的猪血并没有被真正利用起来，仅仅是被人们 用来作为一种菜肴，这即浪费了宝贵的生物资源， 也 造成严重的环境污染。 热反应型肉味香精的由来已久，大约在 150 年前荷兰的 Leibig 与瑞士的Maggi 就开始尝试用盐酸水解植物蛋白作为肉类风味的替代物 6。国际食品香料香精工业组织（ IOFI）将热加工香精定义为
10、：通过加热食品原料或允许在食品或加工香料中使用的食品组分而制得的具有其风味 特征 的产品 7。基本上所有的肉味香精的前提物质都没有香气，但在加热过程中蛋白质、氨基酸、糖类、有机酸、核苷酸和脂类物质发生了一系列复杂的反应生成各种肉香风味物质。 实验表明肉风味形成的主要途径有香气前提物质（肽和氨基酸、糖类、硫胺素）的降解、 Maillard 反应及脂质的氧化作用 8-12。后来，随着风味物质分析化学领域有了质的飞跃，如 GC、 GC-MS 技术等，可以将肉味香精中产生的挥发性香味 的 成分检测出来。 迄今为止，已有超过 1000 种肉香风味物质被分离鉴定出来，如醛类、酮类、呋喃、吡嗪、吡啶、噻吩、
11、含硫化合物、烯醛类化合物等 13 。肉香风味物质的研究促进了相关化学物质的合成与分离 的发展 ， 同时也 促进了香料工业的发展 14。 本论文主要研究利用中性蛋白酶水解后的猪血水解液为反应原材料，加入适量的葡萄糖、硫胺素、牛磺酸、 L-cys 以及抗坏血酸，设置一定的反应温度、初2 始 pH、反应时间，在自行组装的装置下进行 Maillard 反应。首先通过两水平八因素挑选试验制备得到十二种 在 不同条件下制得的热反应型肉味香精，再对在 每种肉味香精进行颜色、肉味强度、 回味感 三个方面的感官评定分析，以统一的打分方法对每种产物分别打分，使得到相应的分数。以此来确定影响肉味香精风味的最主要的三
12、个因素。 得到 这三个因素分别是猪血酶解液的用量、硫胺素用量和反应所需温度。然后 再 控制葡萄糖用量、牛磺酸用量、 L-cys 用量及初始 pH 和反应时间 这些 条件不变， 而 以猪血酶解液的用量、硫胺素用量和反应所需温度这三个因素为变量，改变条件进行实验并对反应产物进行感官分析，最终通过提取响应面来优化工艺，得到最佳的肉味香精制备工艺。 2材料与方法 2.1 实验材料 猪血酶解 液 2.1.1 实验仪器 表 1 仪器设备 Table 1 Instrument and Equipment 仪器名称 型号 生产厂家 数显恒温水浴锅 HH-4 国华电器有限公司 离心机 TGL-20bR 江苏捷达
13、制造有限公司 电子天平 PL203 梅特勒 托利多仪器（上海）有限公司 恒温加热器 ZN-175 泰明机械设备有限公司 2.1.2 药品试剂 表 2 药品试剂 Table 2 Agents 葡萄糖 分析纯 天津博迪化工股份有限公司 抗坏血酸 (Vc) 分析纯 天津博迪化工股份有限公司 牛磺酸 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 盐酸硫胺 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 半胱氨酸（ L-cys） 分析纯 上海蓝季科技发展有限公司 3 2.2 实验方法 2.2.1 猪血红蛋白酶解液的制备 将新鲜猪血离心后，取 10.0g 猪血 蛋白 ，加入 pH 值为 7.0 的磷酸缓冲液50ml， 再 加入中性
14、蛋白酶 800U/g，充分搅拌溶解后在 50.0 下水解 2 小时， 放入 100 水浴， 5min 灭酶、离心 ，取上清液， 制得。 2.2.2 肉味香精制备的方法 定量称取各种反应原料，放入烧瓶中，充分搅拌使反应原料完 全溶解。再用 1mol/L 的氢氧化钠溶液来调节其 pH，以达到相应的初始 pH。然后倒入三口瓶中，在一定的温度下进行反应一定的时间。反应结束取出三口烧瓶，迅速冷却至室温。 2.2.3 肉味香精的工艺优化试验 2.2.3.1 两水平因素 试 验 以猪血酶解液、葡萄糖、牛磺酸、硫胺素和半胱氨酸（ L-cys）的用量以及反应时间、温度和初始 pH 这八个因素为变量来设计实验。每
15、组实验都在各自的条件下进行 Maillard 反应，最终将所得产物保存在棕色试剂瓶中低温保存。 表 3 试验设计表 Table 3 Experiment Design X1 水解液 ml X2 葡萄糖 g X3 牛磺酸 g X4 硫胺素 g X5 L-cys g X6 时间 min X7 温度 X8 pH 1 50.0 15.0 3.0 1.0 2.5 45 100 7.5 2 50.0 20.0 2.0 1.5 2.5 45 90 7.5 3 35.0 20.0 3.0 1.0 3.75 45 90 6.0 4 50.0 15.0 3.0 1.5 2.5 60 90 6.0 5 50.0 2
16、0.0 2.0 1.5 3.75 45 100 6.0 6 50.0 20.0 3.0 1.0 3.75 60 90 7.5 7 35.0 20.0 3.0 1.5 2.5 60 100 6.0 8 35.0 15.0 3.0 1.5 3.75 45 100 7.5 9 35.0 15.0 2.0 1.5 3.75 60 90 7.5 10 50.0 15.0 2.0 1.0 3.75 60 100 6.0 11 35.0 20.0 2.0 1.0 2.5 60 100 7.5 12 35.0 15.0 2.0 1.0 2.5 45 90 6.0 4 2.2.3.2 感官评定方法 肉味香精的感
17、官特性是一种复杂效果，主要包括香精的基本味、香气、口感、化学性感官因素等特性。我们 将每组样品取一定的量后分别用蒸馏水稀释十倍，对产品进行随机编号，分别对颜色、肉味强度、回味感三个因子进行打分，且赋予它们相同的权重，以全面考虑样品的各种指标。若各方面都令评价人员感觉良好则分数高；若风味令人不愉快则分数低。最后计算出各个样品的总分，最高的则为风味最佳的，以此类推。 表 4 评分表依据 Table 4 Weights of Evaluation Indexes of Pork Flavor Aroma 项目 标准 满分 颜色 颜色均匀且为棕褐色 10 肉味强度 香气直冲、留香持久 10 回味感 回
18、味鲜香绵长、持久 10 2.2.3.3 响应面试验 从两水平因素试验中挑选的对热反应制备的肉味香精的风味影响最大的三个因素分别是猪血酶解液的用量、硫胺素和反应温度。控制其他反应条件不变的情况下对这三个因素进行试验，并结合感官分析（方法与上相同），最终通过响应面 设计 来优化制备工艺。 表 5 响应面试验设计表 Table 5 Box-Behnken Design Y1 水 解液 ml Y2 硫胺素 g Y3 温度 1 20 0.8 100 2 20 1.8 100 3 50 0.8 100 4 50 1.8 100 5 35 0.8 80 6 35 0.8 120 7 35 1.8 80 8
19、35 1.8 120 5 9 20 1.3 80 10 50 1.3 80 11 20 1.3 120 12 50 1.3 120 13 35 1.3 100 14 35 1.3 100 15 35 1.3 100 3.结果与分析 3.1 两水平因素 试 验所得产物 的感官分析结果 3.1.1Plackett-Burman设计筛选重要因素 影响 肉味香精 风味 的因素：猪血酶解液、葡萄糖、牛磺酸、硫胺素和半胱氨酸（ L-cys）的用量以及反应时间、温度和初始 pH，分别作为 PB实验的 8个因素X1、 X2、 X3、 X4、 X5、 X6、 X7、 X8，选用 N=12的 PB设计，每个因素分
20、别取 2个水平，高水平取低水平的 1.25倍。以肉味香精的感官评定分数为 Y。实验设计如表六所示。本研究的实验设计、数据分析及模型建立皆采用 SAS软件来进行。 表 6 N=12的两水平因素实验设计及结果表 Table 6 Plackett-Burman Design and The Result 实验号 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 分数 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 27.0 2 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 11.8 3 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 15.9 4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 15.6 5 1 1 -1 1
21、 1 -1 1 -1 23.0 6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 20.2 7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 23.5 8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 9.4 9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 8.1 10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 26.6 11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 25.6 12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 17.6 6 3.1.2方差分析表 利用 SAS软件对 Plackett-Burman实验结果进行系数显著性检验。结果表明，猪血水解液用量、硫胺素用量、反应温度均为显著因素，对制备肉味香精的风味有显
22、著影响。 表 7 各因 素水平及其主效应 Table 7 Factors Level and Main Effect 方差来源 自由度 平方和 均方 F 值 P 值 Prob F 排列 X1 1 48.40083 48.40083 6.977814 0.077553 3 X2 1 20.54083 20.54083 2.961315 0.183762 6 X3 1 0.100833 0.100833 0.014537 0.911654 8 X4 1 143.5208 143.5208 20.691 0.019905 2 X5 1 26.70083 26.70083 3.849385 0.144
23、572 5 X6 1 18.50083 18.50083 2.667214 0.200942 7 X7 1 175.5675 175.5675 25.31108 0.015134 1 X8 1 33.6675 33.6675 4.85375 0.114836 4 模型 8 467 58.375 8.415762 0.053514 误差项 3 20.80917 6.936389 总和 11 487.8092 因素 筛选结果： X1,X4,X7 即水解液用量、硫胺素、反应温度为显著因素。 3.2 响应面 试 验的结果 3.2.1 响应面分析法确定最佳值域 由以上 PB 试验分析结果可知，影响肉味香精风味的 3 个显著因素分别是猪血水解液用量、硫胺素、反应温度。因此，本试验以肉味香精的感官评定分数为响应值，自变量为猪血水解液用量、硫胺素、反应过程温度，分别 用 X1、 X2、X3 代表，按方程 xi=(Xi-X0)/ X 对自变量进行编码，其中， xi 为自变量的编码值，Xi 为自变量的真实值， X0 为试验中心处自变量的真实值， X 为自变量的变化步长。可得： x1=（ X1-35） /15， x2=（ X2-1.3） /0.5， x3=（ X3-100） /20，试验设计及结果见表八，因子编码及各自变量水平见表九。
