1、 本科毕业论文 （ 20 届） 食品科学与工程 响应面法优化桑叶黄酮提取工艺条件的研究 i 摘 要 通过单因素和响应面分析法，研究了超声乙醇提取桑叶黄酮的工艺参数。以芦丁为指标，通过单因素试验确定了桑叶超声提取黄酮的超声功率， 提取 温度，料液比，乙醇浓度，通过响应面分析法确定了最佳提取条件。单因素试验表明桑叶黄酮提取的乙醇浓度最适范围 60-80%， 提取 温度最适范围为 60-80 ，超声功率最适范围为 100-200W，最适料液比为 1： 40， 另 外，通过 Design-expert 软件设计响应面优化法得到的最佳提 取条件为乙醇浓度 71.6%， 提取 温度 68.4 ，超声功率为
2、 152.6W， 桑 叶黄酮提取理论得率为 4.8%。 关键词 : 桑叶；总黄酮；提取工艺 ； 超声提取 ii ABSTRACT This study investigated the technological parameter of ultrasound extraction of flavonoids from the mulberry leaves with the single factor and response surface methodobgy. The results showed that, ultrasonic extraction power , were mai
3、n factors to affect the extraction rate of flavonoids. Optimum range of ultrasonic extraction temperture, ethanol concentration and the ratio of solvent to material were 60-80, 60%-80%, 100W-200W respectively. Based on the response surface methodology by Design-expert, The optimum parameters was as
4、follow: ethanol concentration was 71.6%, ultrasonic extraction temperature was 68.4 , ultrasonic extraction power was 152.6W, extract theory rate of mulberry leaf flavonoid is 4.8%. Key words: mulberry leaves, flavonoids, technological parameter, ultrasound extractionI 目 录 1 前言 . 1 2 材料和方法 . 1 2.1 实
5、验材料 . 1 2.2 试验方法 . 1 2.2.1 原材料预 处理 . 1 2.2.2 标准曲线的绘制 . 1 2.2.3 桑叶黄酮提取 . 2 2.2.4 桑叶黄酮提取最佳工艺条件的确定 . 2 3 结果与讨论 . 2 3.1 标准曲线 . 2 3.2 单因素实验结果 . 3 3.2.1 温度对黄酮提 取得率的影响 . 3 3.2.2 超声功率对黄酮提取得率的影响 . 3 3.2.3 乙醇体积分数对黄酮提取得率的影响 . 4 3.2.4 料液比对黄酮提取得率的影响 . 5 3.3 响应面实验设计及结果分析 . 5 3.4 响应面和等高线分析 . 7 3.5 最佳提取工艺确定 . 9 3.6
6、 最佳提取工艺的验证 . 9 4 结论 . 9 参考文献 . 10 1 1 前言 桑叶为桑科（ Moraceae）桑属植物桑 (Morus dba L)的叶，味苦，甘，性寒，归肺、肝经，具有疏散风热、清肺润燥、平肝明目、凉血止血之功效 1。近代医家也常将桑叶用于治疗糖尿病且得到满意的疗效。现代药理研究证实桑叶具有抑制血清脂质增加和抑制动脉粥样硬化形成及降血糖的作用 2。桑叶中黄酮类成分含量丰富，含量约占干叶重的 1.0%3.0%，是植物茎叶中黄酮类化合 物含量较高的一种 3。黄酮类化合物因其生理活性多种多样，引起了国内外学者的广泛重视，研究进展很快。它具有良好的抗自由基、抗氧化、抗衰老、降血脂
7、、免疫调节、抗菌等生理活性，具有广阔的应用前景 4, 5。响应面分析法（ Response Surface Methodobgy， RSM)是一种常用的实验设计与分析的方法，其以最经济的方式、较少的实验次数和较短的时间对所有所选实验参数进行全面分析，得出结论正确，可靠，已在生物资源深加工领域得到广泛应用 6-9。本研究采用响应面优化醇溶液提取桑叶黄酮工艺，为工业化生 产桑叶黄酮提供参考。 2 材料和方法 2.1 实验材料 桑叶；芦丁，化学对照品，国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇等均为分析纯。 UV-2102PC 型紫外可见分光光度计；超声波细胞破碎器 上海之信仪器有限
8、公司；电子天平； HH-4 数显恒温水浴锅 金坛市城西春兰实验仪器厂。 2.2 试验方法 2.2.1 原材料预处理 将桑叶干粉碎后备用。 2.2.2 标准曲线的绘制 标准溶液的配制和标准曲线制作 10 精确称取芦丁对照品 0.4g，用体积分数 70%的乙醇溶解，制成浓度为 0.4g/L标准溶 液，精确吸取标准溶液 0.0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0mL，分别置于 10mL的容量瓶中，加入质量分数 5%亚硝酸钠溶液 0.4mL，放置 6min 后，加入质量分数 10%硝酸铝溶液 0.4mL，静置 6min，再加质量分数 4.3%氢氧化钠溶液 4mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，静
9、置 15min，在 510nm 处 测定吸光度 ，以吸光度为纵坐2 标，芦丁含量为横坐标，测定结果用 Excel 软件作线性回归即可得到标准曲线。 2.2.3 桑叶总黄酮的提取 从干燥后的桑叶粉取 1 g 桑叶粉放入具塞三角瓶中按一定的料液比加入乙醇水溶液， 超声提取一段时间后，趁热过滤。重复提取后合并滤液。将提取液浓缩至 30 mL 左右，高速离心 20 min 后经微孔滤膜过滤，用 70%乙醇定容。用制作标准曲线同样的方法，测定其黄酮类化合物的含量。 桑叶黄酮得率 = WVaY 式中 Y 由标准曲线方程计算出的黄酮浓度， mg/mL； a 稀释体积； V 提取液体积， mL； W 桑叶粉末
10、质量， g。 2.2.4 桑叶黄酮提取最佳工艺条件的确定 首先在不同条件下分别考察乙醇体积分数、提取温度、超声功 率、料液比（ 桑叶粉 ： 醇溶液 ， g： mL）对桑叶黄酮得率的影响；在单因素的基础上，再选择三个因素进行响应面优化试验，确定桑叶黄酮提取的最佳工艺条件 11-13。 3 结果与讨论 3.1 标准曲线 按照 2.2.2 所述方法，绘制芦丁标准曲线。结果如图 1 所示，该标准曲线方程为： Y=0.0152X-0.0147，相关系数 R2=0.9969， 在 0-40mgL-1 质量浓度范围内线性关系良好。 图 1 芦丁标准曲线 Fig1 Standard curve of ruti
11、n 3 3.2 单因素实验结果 3.2.1 温度对黄酮提取得率的影响 称取 1g 桑叶粉，在提取时间为 1h、超声功率 150W、乙醇浓度 70%条件下，分别采用提取温度 50 、 60 、 70 、 80 、 90 ，按料液比 1:40 进行提取，同时做平行试验一次，考察提取温度对桑叶黄酮得率的影响。结果如图 2 所示，随着提取温度升高，桑叶黄酮得率先不断升高，当提取温度超过 70 时，黄酮得率有轻 微下降，这可能是因为随着温度的上升，桑叶黄酮中某些热不稳定性化合物被氧化，使其得率下降 14。因此，综合考虑提取温度定为 60-80 。 2.02.53.03.54.04.55.05.540 5
12、0 60 70 80 90 100温度()得率(%)图 2 提取温度对黄酮得率的影响 Fig2 the yield of flavonoids on extraction temperature 3.2.2 超声功率对黄酮提取得率的影响 称取 1g 桑叶粉，在提取时间 1h、料液比 1:40、提取温度 70 、 70%乙醇条件下，分别采用超声功率 50W、 100W、 150W、 200W、 250W，考察超声功率对桑叶黄酮得率的影响 ，结果见图 3。随着超声功率的增强，桑叶黄酮得率呈上升后下降趋势，当在 150W 时达到最大。当超声功率超过 150W 时，由于部分黄酮可能被破坏，导致黄酮得率
13、降低 15。因此，综合考虑超声功率定为 100-200W。 4 22.533.544.555.50 50 100 150 200 250 300超声功率(W)得率(%)图 3 超声功率对黄酮得率的影响 Fig3 the yield of flavonoids on ultrasonic power 3.2.3 乙醇体积分数对黄酮提取得率的影响 称取 1g 桑叶粉，在提取温度 70 、提取时间 1h、超声功率 150W、料液比 1:40 条件下，分别采用 50%、 60%、 70%、 80%、 90%乙醇提取液，考察乙醇体积分数对桑叶黄酮得率的影响 16。结果如图 4 所示，随着乙醇体积分数的升
14、高，桑叶黄酮得率先不断升高，当乙醇体积分数达到 70%后呈下降趋势。该图表明，在乙醇体积分数大于 70%时，由于醇溶性杂质如叶绿素、叶黄素等溶出量增加，与桑叶黄酮竞争乙醇溶剂，所以导致桑叶黄酮得率降低；而在乙醇体积分数低于 70%时，水溶性杂质如多糖、多肽等含量提高，可导致溶出的桑叶黄酮下降17。因此，综合考虑提取时选择乙醇体积分数定为 60%-80%。 11.522.533.544.555.540 50 60 70 80 90 100乙醇体积分数( % )得率(%)图 4 乙醇体积分数对黄酮得率的影响 5 Fig4 the yield of flavonoids on ethanol con
15、centration 3.2.4 料液比对黄酮提取得率的影响 称取 1g 桑叶粉，在提取温度 70 、提取时间 1h、 70%乙醇、超声功率 150W条件下，按料液比分别为 1:20、 1:30、 1:40、 1;50、 1:60 进行试验，考察其对黄酮得率的影响。试验结果如图 5 所示，当料液比为 1:20、 1:30 时，黄酮得率无显著变化，可能是乙醇溶液饱和，当达到 1:40 时，桑叶黄酮基本溶出料液 ， 超过1:40 后，黄酮得率显著下降，可能因为桑叶黄酮已基 本溶出而且被一定程度稀释，因此，料液比选 1:40 为宜。 2.02.53.03.54.04.55.05.56.010 20
16、30 40 50 60 70料液比(mL/g)得率(%)图 5 料液比对黄酮得率的影响 Fig5 the yield of flavonoids on liquid ratio 3.3 响应面实验设计及结果分析 18-20 基于单因素结果，选定料液比为 1:40，采用统计分析软件 Design-Expert Box-Behnken 方法 建立三因素三水平模型，进行优化设计，确定桑叶黄酮的最佳提取工艺条件。以桑叶黄酮得率 Y 为响应值，温度 (A)，超声功率 (B)，乙醇体积分数 (C)为自变量，分别以 X1、 X2、 X3 表示，变量编码值根据下式计算： xi=(Xi-X0)/ Xi 式中 x
17、i 自变量代码值； Xi 自变量真实值； X0 自变量在试验中心点的真实值； Xi 自变量的变化步长。 X1（提取温度， ）、 X2(超声功率， W)和 X3（乙醇体积分数， %）三个自变量因素编码及水平见表 1. 表 1 因素与水平设计表 6 Tab 1 design table of factors and levels 代码 编码水平 自变量 编码 -1 0 1 A=提取温度 ( ) X1 60 70 80 B=超声功率 (W) X2 100 150 200 C=乙醇体积 (%) X3 60 70 80 响应曲面优化试验设计与结果见表 2 表 2 试验设计与结果 Tab 2 Experi
18、mental Design and Results 编号 X1(温度 ) X2(功率 ) X3(乙醇浓度 ) Y1(得率 )% 1 0 -1 -1 3.6 2 1 1 0 3.5 3 0 0 0 4.8 4 -1 -1 0 3.6 5 0 0 0 4.7 6 -1 0 -1 3.9 7 0 0 0 4.7 8 0 0 0 4.8 9 0 1 1 3.9 10 0 -1 1 4.0 11 1 0 -1 3.8 12 1 0 1 3.3 13 -1 0 1 4.1 14 -1 1 0 3.8 15 1 -1 0 3.3 16 0 1 -1 3.5 17 0 0 0 4.9 回归方程方差分析见表 3，从表 3中可知，一次项中 提取 温度对桑叶黄酮得率有影响（ P=0.01870.05，表明其
