大孔树脂初步纯化卫矛粗提物中的芦丁和槲皮素[外文翻译].doc

1、 1 本科毕业论文外文翻译 译文： 大孔树脂初步纯化卫矛粗提物中的芦丁和槲皮素 来源： Food Bioprod Process (2010), doi: 10. 1016 / j. fbp. 2010. 11. 001 Zhanyi Zhao, LuLu Dong, Yanli Wu, Feng Lin 摘要： 本文采用了五种不同物理和化学性质的大孔树脂对卫矛粗提取中的芦丁和槲皮素进行纯化。静态试验结果表明， AB-8 树脂的吸附数据很好地拟合了朗缪尔静态吸附等温线，具有较好的吸附和解吸能力。选用优选出的 AB-8 树脂 进行动态吸附和解吸实验，主要研究的纯化工艺条件为：上柱样溶液 pH，洗

2、脱剂浓度，洗脱剂pH。在最佳工艺条件下纯化得到的芦丁和槲皮素含分别为 63.1%和 72.3%，分别比纯化前增加 8.45 倍和 13.14 倍。结果表明，该方法适合于大规模从卫矛或其他草药中制备芦丁和槲皮素。 关键词： 纯化；芦丁；槲皮素；卫矛（ Euonymus alatus (Thunb) Siebold）；大孔树脂； 1 引言 卫矛，卫矛属，主要分布在中国、俄罗斯、日本、韩国，大约于 1860 年（ Ma, 2001）首次传到美国。作为传统的中草药，最 早记载于中草药书神农本草药（ Shen, 2005），在中国的本草纲目（ Li, 2003）也有记载。目前，卫矛已被一些亚洲国家长期应

3、用于调控身体机能和血液循环，止痛，排除淤血，条例月经（ Huang and William,1999）。近年来，研究表明卫矛具有多种生物活性，包括防高血压症，防高血糖症（ Fang et al, 2008; Park etal, 2005a）和抗癌 (Cha et al., 2003; Jin et al, 2005; Lee et al., 1993; Park et al., 2005b)。 通过对其化学成分的研究表明，卫矛中主要活性成分是黄酮类化合物（ Cha et al., 2003; Fang et al., 2008; Ishikura and Sato, 1977），先前的研究也

4、显示芦丁和槲皮素主要以黄酮类化合物存在于卫矛中（ Fang et al., 2008; Zhao et al., 2009）。针对芦丁和槲皮素所具有的临床和药理作用，目前迫切需要一种高效、低成本的技术来纯化这两种化合物，其结果如图 1。在植物化学产品的制造过程中，植物中有效成分的提取纯化是非常重要 的步骤。常用的提取方法有许多种，其中液液萃取（ Dinan et al., 2001）和离子交换（ Skelly and Crummett, 1971），已经广泛应用于从天然资源中分离纯化生物活性物质。但是，这些方法效率低，时间长，溶剂消耗量大。最近，用2 吸附剂吸附传统草药中的生物活性物质与日俱增

5、，因为其具有温和的纯化效果。在所有的吸附剂中，大孔树脂因其廉价和易再生的特点，广泛用于纯化许多次级代谢产物，包括橙皮苷（ Scordino et al., 2003），花色苷（ Di Mauro e al., 2002），染 料木素和芹菜素（ Liu et al., 2010），甘草黄酮类化合物（ Fu et al.,2005）和茶多酚（ Silva et al., 2007）。然而，目前尚未报告过用大孔树脂纯化卫矛中的芦丁和槲皮素。 本研究调查了芦丁和槲皮素在不同极性的大孔树脂中的吸附和解吸性能，主要的目的是研究出 AB-8 树脂纯化卫矛粗提物中芦丁和槲皮素的最佳工艺条件。 2 试验 2.1

6、 试剂和材料 芦丁和槲皮素的标准溶液必须符合国家标准，因为国家对制药和生物药品都有严格的控制（北京，中国）。芦丁和槲皮素都溶解在甲醇溶液中，得到 浓度为0.64mg/mL 的标准溶液。用甲醇溶液稀释标准溶液以得到相应的校准曲线。用 Mill-Q系统净化去离子水。甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。卫矛于 2007 年在中国黑龙江省收集，并由李淳民教授鉴定（黑龙江药检所）。整个工厂被用于研究。 2.2 吸附剂 NKA-、 AB-8、 X-5、 S-8 和 D-101 树脂均购自于南开大学化工厂（天津，中国），其物理性能如表 1 所示。新购的树脂浸泡在 95%乙醇溶液中，振荡 24h后，用去离子水彻底

7、清洗后方可使用。树脂的含水量测定方法为：准确称取这 3 种大孔树脂，然后放置在 110的 烘箱中，直到质量不再改变。测定结果表明： NKA-2、 AB-8，S-8、 D-101 树脂的含水量分别为 1.6%， 66.7%， 63.9%， 61.2%和 73.2%。 3 2.3 卫矛粗提物的制备 卫矛粉末（ 200g）在 2000mL 的乙醇溶液（ 60 40， V/V）中，回流 1.5h，提取三次后合并提取液，过滤，在 60的旋转蒸发器上旋转至干。粗提物的提取率为30mg/g。其中芦丁和槲皮素的含量分别为 1.93%和 1.32%。用去离子水配制得到浓度为 0.3538mg/mL 和 0.24

8、20mg/mL 的芦丁和槲皮素溶液。 2.4 高效液相色谱法分析芦丁和槲皮素 岛津高效液相色谱（日本）包括二元泵，在线脱气器和二级管阵列检测器（ DAD），用于分析芦丁和槲皮素的成分。在色谱分析时，必须在室温下使用带有C18 薄垫片（ 4.6mm 10mm）的 C18 液相色谱柱（ 4.6mm 150mm） 。流动相为 甲醇鈥载水磷酸 （ 42 57.5 0.5， V/V/V）；流速为 1.0mL/min；波长为 340nm。所有实验所得溶液都经膜过滤器（ 0.45m）后，才进行高相液相色谱分析，进样量为 5L。芦丁和槲皮素的保留时间分别为 5.6min 和 15.2min。分析物的色 谱峰的

9、确定通过比较保留时间和参考标准的紫外光谱， 5 个实验建立标准曲线。芦丁和槲皮素的回归线分别是 Y=934.21X 8460.2（ R2=0.9996， n=5）， Y=1864.2X 35712（ R2=0.9994，n=5），其中 Y 为分析物的峰面积， X 为分析物的质量。 2.5 静态吸附和解吸实验 大孔树脂纯化卫矛粗提物的静态吸附实验操作如下：准确称取 1g（干重）树脂，将其加入到含有 30mL 卫矛粗提物（芦丁的浓度为 0.3538mg/mL，槲皮素浓度为0.2420mg/mL）中，在 25的恒温摇床（ 110rpm）中 振荡 7h。待吸附完全后，采用高效液相色谱法分析。吸附量由以

10、下公式计算： e=（ Co Ce） Vi/（ 1 M） W （ 1） 其中 e 是洗脱平衡后的吸附量（ mg/g）； Co 和 Ce 分别是分析物的初始浓度和平衡浓度（ mg/mL）； Vi 为初始样品的体积（ mL）； M 为树脂的含水量； W 为树脂的质量（ g）。 静态解析实验操作如下：吸附饱和的树脂先用去离子水冲洗，然后用 30mL 的4 乙醇溶液（ 60 40， V/V）解吸。在 25的摇床（ 100rpm）中振荡 7h。解吸完全后，采用高效液相色谱法分析。解吸量和解析率分别由以下公式计算 d=CdVd/（ 1 M） W （ 2） D=CdVd/（ Co Ce） Vi 100% （

11、3） 其中 d为解吸平衡后的解吸量； Cd 为解吸液的浓度（ mg/mL）； Vd 为解吸液的体积（ mL）； D 为解析率（ %）； Cd、 Co、 Vi、 M 和 W 分别与上述相同。吸附和解吸实验重复 3 次 。 根据芦丁和槲皮素溶液在某个时间的吸附浓度，确定平衡吸附动力学曲线。树脂的选择性是基于吸附量和解吸量，吸附和解吸的速度。 优选出的大孔吸附树脂进行吸附等温线实验。在不同浓度的样品溶液中加入 1g（干重）树脂，分别在 25、 30、 35下振荡 7h。不同温度下的初始溶液浓度和平衡溶液浓度采用高效液相色谱法分析。朗 缪尔和弗式方程常用来描述吸附剂对吸附材料的吸附能力（ Al Dur

12、i, 1996; Langmuir, 1918）。朗缪尔等温式是最有名的从溶液中吸附溶质的等温线。朗缪尔方程如下所示： e= mCe/（ K Ce） (4) 其中 e 为吸附量（ mg/g）； Ce 为吸附平衡后溶液浓度； K 为吸附平衡常数； e 为经验常数。另一个广泛使用的理论模型 弗式等温式，则是一个非理想吸附公式。弗式方程如下所示： e=KCe1/n （ 5） 其中 K 是弗式常数， 1/n是经验常数； e 和 Ce 与上述相同。 在不同条件下对最佳树脂的 吸附和解吸特性进行分析，主要包括上柱液 pH 值、洗脱剂乙醇浓度和 pH 值。吸附或解吸平衡后，实验结果采用高效液相色谱法进行分析

13、。 2.6 动态吸附和解吸实验 在装有 6g（干重）选定树脂的层析柱上（ 12nm 500mm）进行动态吸附和解吸实验，树脂体积（ BV）为 30mL。样品溶液通过层析柱的流速为 1.5mL/min，流出液中芦丁和槲皮素的含量用高效液相色谱法分析。达到吸附饱和后，先用去离子水洗柱，然后用乙醇溶液以 1.5mL/min 的速度过柱，解吸液中芦丁和槲皮素的含量也用高效液相色谱法分析。 5 3 结果与分析 3.1 吸附和解吸量、解析率 树脂的吸附和解吸能力与溶质的化学特性有关。一方面，树脂与溶质极性相似，则对其有较好的吸附能力，另一方面，树脂的物理特性在吸附和解吸过程也发挥着重要的作用，如图 2 所

14、示。 AB-8 树脂中的芦丁和槲皮素含量最高。究其原因，不仅因为 AB-8 树脂具有与芦丁和槲皮素相同的的极性，还因为其有较高的表面积。 AB-8 树脂的吸附量明显高于其他树脂，可能因为其具有与吸附物相同的化学特性。 NKA-树脂的解吸率最低，因为 KNA-具有很强的亲和力，从而对芦丁和槲皮素解吸效果不显著。总而言之， AB-8 树 脂对芦丁和槲皮素具有良好的吸附和解吸能力。 3.2 树脂吸附动力学 芦丁和槲皮素在不同树脂中的吸附动力学曲线，如图 3A 所示。在所有树脂中，槲皮素的吸附能力随着接触时间的增加而增加，直到平衡。在 AB-8、 X-5 和 D-101树脂中，槲皮素的平衡时间在 70

15、min 左右，在 NKA-和 S-8 中的平衡时间分别在65min 左右。实验结果表明，芦丁和槲皮素在吸附动力学中有相似的趋势。相对而言， AB-8 树脂对芦丁和槲皮素吸附效果最好，故选用 AB-8 树脂进行以下实验。 6 3.3 静态吸附等温线 在 25、 30 和 35下，进行 AB-8 树脂吸附芦丁和槲皮素的静态吸附等温线。芦丁的初始浓度分别为 0.0885、 0.1327、 0.1768、 0.2211、 1.2654 和 0.3538mg/mL，槲皮素的初始浓度分别为 0.0605、 0.0908、 0.1210、 0.1513、 0.1815 和 0.2420mg/mL。从吸附等温

16、线（图 3b）可知，槲皮素的吸附量随着初始浓度的增加而增加，芦丁的吸附量也随着初始浓度的增加而增加。 平衡值可表现出吸附剂和溶剂之间的亲和力。朗缪尔和弗式方程可以进行重新安排，以 Ce 和 Ce/ e 为自变量，对实验数据进行统计分析，获 得 R2。 Ce/ e=Ce/ m K/ m (6) 弗式方程被广泛应用于物理吸附和化学吸附。朗缪尔和弗式方程的参数列于表2。 7 从表 2 可以看出，芦丁和槲皮素在朗缪尔和弗式方程中具有较高的相关系数，表明吸附过程单向进行。一般来说，在弗式方程， 1/n值介于 0.10.5 之间，则表明吸附容易发生， 1/n值介于 0.51 之间，则表明不易发生。在表 2

17、 中， 1/n值介于 0.10.5之间，表明 AB-8 树脂容易吸附芦丁和槲 皮素。因此， AB-8 树脂最适于吸附这两个化合物。 从图 3B 可以看出，在相同的初始浓度下，吸附量随着温度的增加而下降，表明吸附是一个放热的过程。因此，选用 25进行以下实验。 3.4 样品溶液 pH 值对吸附能力的影响 初始溶液 pH 值主要影响吸附剂和溶质之间的亲和力，从而影响树脂的吸附能力。如表 3 所示，在 pH 值为 6 时芦丁和槲皮素的吸附量最高， pH 值低于 7 后，大孔树脂的吸附量没有明显变化。但 pH 值到达 8 后，芦丁和槲皮素的吸附量迅速下降。因为氢键在 AB-8 树脂的吸附过程中发挥着重

18、要作用，较高的 pH 值会降低氢键的相互作 用，从而降低树脂的吸附能力。因此，上柱液 pH 值为 6 为佳。 3.5 乙醇溶液 pH 值对芦丁和槲皮素解吸率和纯度的影响 从图 4A 可知，芦丁和槲皮素的解吸率随着乙醇溶液的 pH 值的增加而降低。在乙醇溶液 pH 值为 5 时，解吸率最大。但当 pH值从 5 到达 6 后，芦丁和槲皮素的纯度明显下降，因为具有较强极性的杂质在低 pH 值下被解吸。而且，乙醇溶液 pH值超过 5 后，芦丁和槲皮素的解吸率也略有下降。因此，洗脱液的 pH 值为 6 最佳，并在下面的实验中使用。 8 3.6 乙醇浓度对芦丁和槲皮素解吸率和纯度的影响 用不用浓度的乙醇溶

19、液进行解 吸实验，以选择合适的洗脱液，如图 4B 所示。芦丁和槲皮素的解吸率随着乙醇浓度的增加而增加，但到达 70%的浓度后，则随着浓度的增加而降低。从图 4B 中可以看出，当浓度超过 60%后，芦丁和槲皮素的纯度均有所下降，因为有较多的杂质被解吸出来。综合考虑，选择乙醇水溶液（ 6040， V/V）为洗脱液最佳，并在下面实验使用。 3.7 AB-8 树脂的动态吸附曲线 AB-8 树脂的动态吸附曲线是以溶液体积和溶质浓度为依据的，如图 5A 所示。槲皮素溶液在 160mL(泄漏点 )开始被 AB-8 树脂吸附，在此泄漏点后槲皮素的浓度迅速上升，直 到稳定于 300mL。而芦丁的稳定点比槲皮素发

20、生的早。但是这两个化学物的进样浓度与出样浓度比都在 1-5%间，因为他们有不同的初始浓度和溢出速度。因此，取 160mL 芦丁和槲皮素溶液进行动态吸附试验。 9 3.8 AB-8 树脂动态解吸曲线 从图 5B 可以看出， AB-8 树脂动态解吸曲线是以解吸液体积和溶质浓度为依据。解吸液体积为 120mL（ 4BV）时，芦丁和槲皮素完全被解吸出来，解吸液进行真空干燥后称重，计算出芦丁和槲皮素的含量。在最佳条件下重复 3 次，计算出芦丁和槲皮素的回收率（ Eq.(7)） Y=CdVd/（ Co-Ca） Vp 100% （ 7） 其中 Y为回收率（ %）； Ca为流出液中分析物的浓度； Vp为处理样

21、品溶液的体积（ mL）；Co， Cd详见 2.5。 结果表明，经 AB-8 树脂处理后，芦丁和槲皮素的含量分别为 16.31%和 17.35%，恢复产量分别为 63.1%和 72.3%。 AB-8 树脂处理前后的样品色素图如图 6A 和图 6B。标准的色谱图如图 6C。通过比较可以看出， AB-8 树脂分离明显，较多的杂质被除去，芦丁和槲皮素的峰面积也相对增加。 AB-8 树脂纯 化芦丁和槲皮素的最佳工艺参数如下，吸附时：芦丁和槲皮素的样品溶液浓度分别为 0.3538mg/mL 和0.2420mg/mL，上柱体积为 5.3BV，流速为 1.5mL/min， pH6；解吸时：乙醇水溶液（ 60:40， V/V）， pH6，洗脱剂体积为 4BV，流速为 1.5mL/min。 如何进一步获得较高纯度的这两种化合物，目前正在研究的超滤膜技术是一个很有效的纯化天然产品的方法（ Martin Lo et al., 2005; Zhang et al., 2010）。 10 4 结论 本实验成功实现大孔树脂纯化芦丁和槲皮 素。实验结果表明， AB-8 树脂具有较高的吸附和解吸能力，并能给芦丁和槲皮素提供良好的朗缪尔和弗式等温线。最佳树脂（ AB-8）成功纯化出含量较高的芦丁和槲皮素。总之，这是一个非常有效的从卫矛或者其他草本植物粗提物中纯化芦丁和槲皮素的方法。