1、 1 本科毕业论文外文翻译 译文： 水果中活性物质的体外抗氧化研究 来源： Food Sci. Biotechnol. 19(3): 725-734 (2010) Nataraj Loganayaki and Sellamuthu Manian 摘要： 本文研究，用甲醇溶液从蒲桃，九里香，红瓜，仙人掌，樱桃，柑橘，Canthium Parviflorum，马缨丹，八角枫，桑果等 10中水果中提取抗氧化物质。建立评价抗氧化物在体外清除自由基能力模型，例如降低铁的氧化性（ FRAP），清除2,2-二苯基 -1-苦味基肼（ DPPH）， 2,2-连氮 -二（ 3-乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸）铵盐（
2、ABTS），羟基（ OH），一氧化氮自由基（ NO），超氧化物自由基（ O2）以及金属螯合反应。所有水果提取物中均含有石碳酸，单宁酸和类黄酮等物质。仙人掌，九里香，柑橘，马缨丹和桑果中提取物对 DPPH， ABTS+和 FRAP 等进行检测，发现提取物对它们有很强的清除能力。这些水果中酚类抗氧化物含量丰富。所有提取物对 NO， O2和 OH的清除能力，都要和标准丁基羟基茴香醚（ BHA）对比。研究结果发现，这些未充分利用水果是获取天然抗氧化物 /保健品 的潜在良好资源。 关键词： 未成熟水果； 柑橘 ； Canthium parviflorum；仙人掌；抗氧化剂 介绍 一系列植物衍生膳食补充剂
3、，如植物素和维生素原可以维持人体健康和预防疾病，现在已被定义为功能性食品，营养保健品和营养品。大量资料和科学实验证实，吃不同种类的食品对人体健康非常有利。在此背景下，水果和蔬菜不仅含有丰富的营养，而且能预防危害人体健康的慢性疾病，如癌症，心血管疾病，白内障，糖尿病和神经退化性疾病如老年痴呆症和帕金森综合症（ 1）。水果中主要抗病成分是不同种类的抗氧化剂（ 2）。水果中植物抗氧 化因子包括酚类化合物，类胡萝卜素，Vc和 VE。水果中酚类化合物是主要的天然抗氧化物，它们种类繁多且分布广，对活性氧和带电物质具有清除能力。 热带和亚热带水果具有广泛药用价值，已被众人所熟悉。此外一些传统水果未被充分利用
4、，尤其是在农村地区。与普通商业水果相比，这些水果一般是很难吃，知名度不高，不熟悉，以及作为抗氧化剂来源没有收到足够重视。这可能是当地人2 对它们缺乏认识，营养成分和物理性质不够了解，以及缺乏必要的商业推广。这些水果中特殊植物成分对人体健康非常有益。综合以上信息，我们选择了 蒲桃，九里香，红瓜，仙人掌 ，樱桃，柑橘， Canthium Parviflorum，马缨丹，八角枫，桑果等10水果进行研究，且这些水果偶尔被印度村庄人食用。它们除含有较高营养价值（如Vc， VE和碳水化合物），还包含了大量潜在医疗保健价值的植物化学物质。 水果，蔬菜和其它植物类产品中，总抗氧化物含量测定不能用单一测量方法进
5、行测定。主要是植物化学物质结构复杂，能参与多种机制和特征反应。因此，确定多种测量方法对抗氧化物和天然潜在抗氧化物进行测量。本文研究目的是评估和比较未充分利用水果提取物，在体外测量氧化铁的还原能力（ FRAP），以及对 ABTS，DPPH， Fe2+螯合物， OH， NO的清除能力。此外，对石碳酸，单宁酸和类黄酮等总量进行测定。这些数据为测量未充分利用水果天然抗氧化剂含量，提供非常有价值的信息。 材料与方法 化学药品： 2,2-二苯基 -1-苦味基肼（ DPPH）， 2,2-连氮 -二（ 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）铵盐（ ABTS）和 6-羟基 -2,5,7,8-四甲基二氢苯并哌喃 -2-羧
6、酸（ Trolox）均购买于 Sigma-Aldrich（班加罗尔，印度）。乙二胺四乙酸（ EDTA）二钠和盐酸羟胺从 Merck（孟买，印度）购买。所用试剂均 为分析纯。 水果材料 ：新鲜仙人掌，蒲桃，九里香，红瓜，樱桃，柑橘， Canthium Parviflorum，马缨丹，八角枫，桑果等，在 2008年 10月从腐蚀区 （ Gobichettipalayam and Sathiyamangalam）和泰米尔那都的哥印拜陀（ Pollachi）区（印度）采购。将水果清洗干净，放到 -40中进行冷冻干燥。干燥样品储存在带有丝口的品中，待下次分析用。 提取物制备： 冷冻干燥样品放到 50ml
7、甲醇提取液中（ 1:5， w/v），在 25环境中用机械混合仪震荡混合 24h。混合物放到 6000g离心机中离心 10min。离心得到的球状物用前面方法再加入 50ml甲醇液。将各种提取液进行混合，用真空旋转蒸发仪（ RE300; Yamato,东京，日本）降压蒸发，剩余水分用冷冻干燥法进行去除。冷冻干燥获得的抗氧化物质，直接用各种化学物质分析其抗氧化活性。 营养成分分析 ：一些必须营养物质如：蛋白质，碳水化合物，氨基酸和还原糖将用洛瑞 ，蒽酮，茚三酮和 dinitrosalyclic酸 等进行实验测定。 Vc检测分析 ： Vc用改良 2,6-二氯酚靛酚（ DIP）法进行测定（ 3）。 1g
8、甲醇水果3 提取物溶解于 1ml 含有 1%偏磷酸溶液中，然后放在 Whatman 1号试纸中过 滤。 9ml含有 50M的 DIP液放在室温孵化 15s，在 515nm处用分光光度计对其颜色进行测定。水果提取物 Vc吸光值，与不同浓度标准 Vc吸光值进行比较。 酚类和单宁酸检测分析 ：水果中酚类提取物用 Folin-Ciocalteu法进行测定。相同单宁酸经过聚乙烯比咯烷酮（ PVPP）处理后进行测定。酚类和单宁酸计算是以没食子酸量进行计算（ 4）。 类黄酮检测分析 ：样品提取物中酚类物质测量用前面描述光比色改进法测量（ 5）。 0.5ml（ 1mg/ml 甲醇）提取物加入到 2ml蒸馏水中
9、混合，再加入 0.15ml含有5% NaNO2溶液。在室温孵化 6min后，加入 0.15ml 10% AlCl3液反应 6min，再加入 2ml 4% NaOH混合反应。立即向里面加入蒸馏水定容至 5ml，然后将其充分混合反应15min。混合液在 510 nm处测量其吸光值，蒸馏水作为对照液。芦丁用于类黄酮化合物测量的标准物。所有测量值均用芦丁当量（ RE） /100g提取物表示。 清除活性 DPPH实验法： 不同水果提取物中活性 DPPH去除，用 Blios法进行测定。提取物 IC50值是计算提取物中初始 DPPH减 少 50%时的值。 清除活性 ABTS+实验法 ： ABTS溶解在水中制
10、成 7 mM溶液。 ABTS+是 ABTS原液与 2.45 mM（最终浓度）过硫酸钾在避光环境中反应 12h16h的产物。此前实验中，乙醇稀释液（大约 1:89 v/v）在 30 中达到平衡，将稀释液加入到 1 cm比色皿中，放到 734nm分光光度计处测得吸光值为 0.700.02（ 7）。水果提取物测量时 20%80%吸光值被空白吸收值所掩盖。 1ml ABTS+液中加入 10l水果提取物或标准 Trolox乙醇液（最终浓度在 015mM）。混合液在 30 中反应 30min后，然后对其进行光密度测定。总抗氧化活性（ TAA）单位被定义为具有同等抗氧化活性 Trolox浓度即 mol /g
11、 样品。 FRAP检测分析 ：使用 Pulido等人实验方法对样品提取物中抗氧化物质含量进行测定。新鲜 FRAP（ l 900）溶液中加入 90l蒸馏水和 30l样品液（甲醇作为对照组），放置在 37中孵化反应。样品液和对照液放置在 37水浴锅中反应 30min。最后稀释检测混合样品液反应度为 1/34。 FRAP反应试剂包含了 2.5ml 20 Mmol/L TPTZ液，在40Mmol/L HCl中加入 2.5ml含有 20Mmol/L的 FeCl36H2O和 25ml 0.3mol/L醋酸缓冲液（ pH 3.6）。培养结束后，立即放在 593nm处的分光光度计中进行吸光值测定。用含有浓度为
12、 1002000mol /L的 FeSO47H2O甲醇液绘制标准曲线。抗氧化活性浓度变化量（ EC1）定义为 TPTZ还原减少量相当于 1 Mmol/L FeSO47H2O氧化增加量。 EC1作4 为抗氧化物质浓度的计算，在 FRAP吸光率测定分析中，其理论吸光值增加量相当于增加 1Mmol/L Fe（ ）溶液，确定使用相应的回 归方程。 金属螯合检测分析： 用 Dinis等人（ 9）方法对薄荷提取中的铁进行螯合反应。粗提取物和标准 EDTA溶液中加入 2 Mmol/L FeCl2（ 0.05ml）。反应初始液中加入5Mmol/L菲洛嗪（ 0.2ml）振荡混合，在室温下反应 10min。然后在
13、 562nm处分光光度计中测量其吸光值。 去除羟基（ OH）活性： 用 Klein等人（ 10）实验法，测量水果提取物对羟基的去除能力。在不同含量水果提取物（ 100g， 200g和 300g）试管中，加入 1.0ml 铁-EDTA液（ 0.13% FeSO4和 0.26% EDTA）， EDTA（ 0.018%）液和 1.0ml二甲基亚砜（ DMSO） 0.85%（ v/v） DMSO加入至 0.1M磷酸盐缓冲液， pH 7.4。初始反应液中加入 0.5ml抗坏血酸（ 0.22%），然后放置在 80 90水浴锅中反应 15min。加入1.0ml冰三氯乙酸（ TCA）（ 17.5%， w/v）
14、结束反应。然后向每支试管中加入 3.0ml的纳什试剂，在室温下反应 15min。混合反应没有样品作为对照组。在 412nm处用分光光度计测量实验组的吸光值以及对照组吸光值。羟基清除能力 %（ HRSA）用以下公式进行计 算： %HRSA=（对照 OD-样品 OD） /样品 OD 100 清除一氧化氮自由基（ NO）活性 ：样品测定方法，硝普钠溶解在生理盐水中自动产生 NO， Greiss试剂将促进 NO和 O2发生反应生成亚硝胺盐离子化合物。 NO和 O2发生竞争性清除会导致亚硝胺盐离子化合物减少。此实验，在硝普钠（ 10Mm）磷酸盐缓冲液（ PBS）中加入不同未充分利用水果提取物，在室温下反
15、应 150min。相同反应混合物中没有加入甲醇提取物，但加入等量甲醇作为空白对照组。加入 0.5ml Griess试剂（ 1%磺胺， 2% H3PO4和 0.1% N-(1-萘基 )乙二胺二盐酸盐）结束反应。在546nm处用分光光度计测量发光基团的吸光值（ 11）。 清除超氧自由基（ O2）活性 ：该法是利用核黄素 -光 -硝基四氮唑激发光系统（ NBT），对甲醇提取物抑制或清除超氧化物自由基进行检测（ 12）。 3ml反应混合液中包含 50Mm磷酸盐缓冲液（ pH 7.6）， 20g核黄素， 12Mm EDTA， 0.1mg NBT和 1ml样品液（ 20100g/ml）。不同浓度样品提取混
16、合液起始反应 90s。然后立即放入到 590nm处分光光度计进行吸光值测定。这个反应都在密封的铝箔盒中 进行。相同试管反应混合物放在避光环境中作为对照组。反应混合物中超氧化物自由基的清除百分率用以下公式进行计算： 5 %清除率 =（ A0-A1） /A0 100 此处 A0为对照组吸光值， A1为提取物吸光值。 -胡萝卜素 /亚油酸抗氧化活性测定 ： 1ml -胡萝卜素溶液（氯仿 1mg/10ml）中含有 20mg亚油酸和 200mg吐温 40。氯仿溶液移入到旋转真空蒸发仪中，在 45中蒸发 4min。 50ml含氧蒸馏水缓慢加入到半固体中，使其形成乳状物质。 5ml乳状物质加入到含有 0.1
17、ml抗氧化物提取物中，立即在 470nm处 测量实验组和对照组吸光值，乳状物中不含 -胡萝卜素（ 13）。试管放在 50水浴锅中，每隔 15min测量一次，直到反应 180min为止。所有测试实验都一式三份。提取物抗氧化活性（ AA）和 -胡萝卜素标准清除剂量公式如下： AA=1-（ A0-At） /（ A0 -At） 100 此处 A0和 A0分别为未反应时样品实验组和对照组吸光值。 At和 At分别为样品实验组和对照组反应 180min后的吸光值。 统计分析 ：用 statistica（ Statsoft Inc., Tulsa, OH, USA）软件对不同参数数 据进行方差分析（ ANO
18、VA），以及用复极差法（ P柑橘 九里香 桑果 马缨丹 C.parviflorum八角枫 蒲桃 红瓜 樱桃。结果显示，所有 样品对清除 DPPH自由基都具有影响，据报道仙人掌，柑橘和九里香（ IC50值分别为 43， 52和 54g/ml）具有持续提供氢供体和清除自由基能力。然而，马缨丹和桑果提取物对 DPPH自由基具有中等清除能力。据报道蒲桃皮提取物对 DPPH自由基的清除能力， IC50值达到 168g/ml（ 22）。与此同时，从仙人掌种子中提取出的油脂同样具有清除 DPPH自由基的能力（ 25）。据报道，许多植物性酚类化合物含量与抗氧化活性成正比关系（ 26）。本文研究显示总酚含量与
19、DPPH清除能力成线性关系（ R2=0.848）。天然酚在去除 DPPH自由基时，主要是提供电子 /氢供体（ 27）。也有人发现抗坏血酸， VE，类黄酮，单宁酸和芳香胺能提供氢，从而减少或降低 DPPH的颜色。有趣的是仙人掌中类黄酮含量最低，而 DPPH自由基潜在清除能力却是最高。这主要是此种水果中含有很高的单宁酸（表 1），这可能是主要的抗氧化剂。 Hagerman等人（ 29）研究报道，大分子酚类（单宁酸）物质能有效清除自由基，相当数量的芬香环和环山羟基能取代特殊官能团。 Fukumoto and Mazza（ 30）研究报道，类黄酮具有很高的抗氧化性，主要是因为碳环上存在双键。 图 3
20、未充分利用水果提取物对 DPPH自由基清除能力 清除活性 ABTS+： ABTS+分析是一种很好检测分析法，它能测定氢供体（去除9 水相中自由基）和断链抗氧化剂（去除油脂中自由基）的抗氧化活性。本文研究中，不同样品水果甲醇提取物的去 除能力用 ABTS+表示（ 2281.5-15986.6 mol Trolox/g extract）。与其它水果相比柑橘，九里香，马缨丹和桑果的活性最高，用相等量的芸香甘和槲皮素作为对照组。仙人掌提取物对 ABTS+清除能力，远高于 BHA和 BHT。研究样品中所有 TAA与食品一起食 用时，都被视为功能性营养食品。绝大多数检测水果在 DPPH模型中具有很高的抗氧
21、化性，在 ABTS模型中也具有很高的抗氧化性（ R2=0.616）。它们具有很高的相关性可能是水溶液 /乙醇抗氧化系统很相似。此外，总抗氧化能力与总酚类物质（ R2=0.757）含量和总类黄酮（ R2=0.827）含量具有显著的相关线性。小酚类物质包含类黄酮和石炭酸对自由基清除能力进行了深入的调查和报告（ 31）。最近， Bao等人报道，月桂树果子对 ABTS+具有很强的清除能力，主要是果实中含有大量的花青素，类黄酮和酚类化合物。在不同水果中含有 大量的抗氧化剂如：抗坏血酸， VE，类胡萝卜素和石炭酸。结果是一种水果中含有大量的抗氧化剂。 FRAP： FARP是一种实惠的测量方法，用于抗氧化剂
22、活性测定。分析测量 FARP抗氧化能力，主要是测量酸性环境中 2,4,6-反式 -2-吡啶基三嗪化合物 Fe（ ） -（ TPTZ）22+，变为深蓝色含铁混合物 Fe（） -（ TPTZ） 22+的量。在 593nm处测量溶液吸光值，用铁离子标准液计算 FRAP值。植物提取物具有还原性，可以作为潜在重要抗氧化物（ 32）。不同水果提取物对 FRAP抗氧化能力分析数据如表 2所示。水果提 取物一般都具有很高的抗氧化性，它们的 FRAP值在 157.81258.6 Mmol Fe（） /g。实验水果如柑橘，桑果，马缨丹，九里香和仙人掌的还原性比对照组 BHA强。 FARP与总酚含量（ R2=0.9
23、03）和总类黄酮含量（ R2=0.669） 之间成显著相关性。此外 FARP还与 DPPH和 ABTS清除能力成显著相关性（ FARP对 DPPH为 0.797和 FARP对 ABTS为 0.882）。 FARP和 DPPH值具有相关性，主要是它们具有相同的实验反应机制。 Oktay等人（ 33）报道，很多植物酚类含量与抗氧化活性呈高度相 关性。相似的是一些小水果如越橘，悬钩子和茶糖用 FRAP测量其抗氧化性，结果证实它们都具有还原性，这些水果中含有丰富的植物性化学物（ 34）。 Loots等人（ 35）最近研究报告显示，三甲铁含量的减少与苹果中酚类物质有关，作者认为平苹果汁强抗氧化性，主要是
24、含有大量酚类物质。前面结果清楚的显示，水果提取物能能提供电子与自由基发生反应，生成稳定的物质中止自由基链式反应。 表 2 未充分利用水果提取物对 FRAP, ABTS+清除以及螯合反应 10 金属螯合反应 ：菲洛嗪能与 Fe2+反应生成复合物，但是在螯合反应中，结果会导致 样品红色变浅。因此测量颜色变化，建立螯合反应与螯合剂之间的关系式（ 36）。本实验中，水果提 取物会干扰铁离子和菲洛嗪生成复合物，建议螯合反应前加入菲洛嗪进行反应。结果如表 2 所示，与等量标准 槲皮素和芸香苷相比，柑橘和樱桃提取物中金属螯合反应活性最高（活性 分别为 14.6和 13.2mg EDTA/g提取物）。紧接着是
25、仙人掌，蒲桃，马缨丹和红瓜提取物螯合反应（分别为 10.8， 10.4， 10.2和 10.1 mg EDTA/g提取物）。有趣的是，九里香和桑果在初始阶段具有很强的抗氧化性，而在其他实验中的抗氧化性较弱。抗氧 化主要是清除自由基，抑制链式反应或中止链式反应。其次是抑制自由基形成和防止氧化破坏。尽管马缨丹，蒲桃和红瓜中酚类含量较少 和去除自由基有限，但其中次要抗氧化物质能与金属铁紧密结合。然而，柑橘中含有大量酚类物质，抗氧化活性很高，铁螯合反应既能在主反应中进行，又能在次反应中进行。 一氧化氮自由基清除反应 ： NO 或其它反应物质如 NO2， N2O2， N3O4和 NO3中氮与氧或超氧化合物反应生成活性物质。这些化合物很多都是细胞的结构和功能部位组成物。植物和植物产品中含有清除 NO的物质，它能防止人体产生过量的 NO。NO与炎症 ，肿瘤以及其它病理反应有关（ 37）。水果提取物对 NO 清除研究如图 4所示。最后反应混合液浓度为 100g/ml，水果提取物清除活性物量在 12.452.6%。总之，获得的水果提取物清除能力大小如下：柑橘 桑果 仙人掌 九里香 马缨丹 蒲桃 红瓜 C. parviflorum八角枫 樱桃。这些水果提取物中酚类化合物包含了石炭酸，类黄酮，单宁酸和原花青素，它们具有很强的清除活性。清除活性能中止对人
