1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物工程 哈维氏弧菌 ToxR 部分基因序列克隆与分析 摘 要 哈维氏弧菌是水产病害中主要的致病菌之一。根据已发表的哈维氏弧菌 toxR 基因片段，设计和合成一对上下游简并引物，应用聚合酶链式反应（ PCR）方法，自哈维氏弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段大小约 384bp 的 ToxR 基因片段，将获得的扩增片段进行鉴定和测序，并将测序结果与 GenBank 中已发表的哈维氏弧菌标准菌株的 ToxR基因进行比对，同源性最高，达到了 99%。与基因库中其他弧菌的相应序列对比显 示，该序列与灿烂弧菌的 ToxR 基因有 73%的同源性，与溶藻弧菌的 ToxR 基
2、因有 78%的同源性，与溶珊瑚弧菌的 ToxR 基因有 66%的同源性，与坎氏弧菌的 ToxR 基因有 73%的同源性，与副溶血弧菌的 ToxR 基因有 77%的同源性。该基因编码一个由 116 个氨基酸组成的蛋白质。用 DNASTAR 软件建立系统进化树并对其进行分析，证明这株菌为哈维氏弧菌，并且表明不同致病性弧菌的 ToxR 基因序列存在较大分歧，哈维氏弧菌与进化相近的坎氏弧菌和灿烂弧菌之间能比较容易被鉴别和区分开。 ToxR 基因序列的克隆与分析，为哈维氏弧菌的菌 种鉴定提供了新的分子靶标，有助于其结构和功能的研究及通过突变分析鉴定出新的受 ToxR 基因调控的致病基因。 关键词： 哈维
3、氏弧菌； ToxR 基因；基因克隆；序列分析 ABSTRACT Vibrio harveyi is one of the main pathogenic bacteria of aquatic disease. Based on vibrio harveyi ToxR gene sequences which was published, designing and synthesizing a pair of upstream and downstream primer. We can get a while about the size of 384 bp ToxR genetic fra
4、gments by augmenting pathogenic vibrio harveyi strain genome using polymerase chain reaction (PCR) method. Than identification and sequencing the amplification fragments which we got, and comprising the results of sequencing to the gene ToxR of the standard vibrio harveyi which had published in GenB
5、and, have 99% of the homology. Sequence analysis and alignment of the ToxR nucleotide sequence from vibrio harveyi with those from other Vibrio species revealed that the complete ToxR gene of vibrio harveyi shares 73% sequence similarity with the ToxR gene of Vibrio sp, 78% with Vibrio alginolyticus
6、, 66% with Vibrio coralliilyticus, 73% with Vibrio campbellii, and 77% with Vibrio parahaemolyticus. It encoded a 116 aa protein as expected. Making a evolutionary tree by DNASTAR software and analyzing, we can proving it is the vibrio harveyi, and revealed a wide divergence in ToxR among several pa
7、thogenic vibrios, and vibrio harveyi could be easily distinguished from its close species vibrio sp. Cloning and analyzing of the ToxR sequence, which may be a good target for species identification of vibrio harveyi, would promote structure function studies and mutation analysis so as to identify T
8、oxR-regulated genes. Key word: Vibrio harveyi; ToxR; gene clone; sequence analysisI 目 录 1 前言 . 1 2 材料与方法 . 1 2.1 实验菌株 . 1 2.2 仪器 . 2 2.3 主要试剂 . 2 2.4 培养基 . 2 2.5 哈维氏弧菌总 DNA 的提取 . 2 2.6 ToxR 基因 PCR 扩增 . 3 2.7 PCR 产物的测序 . 3 2.8 扩增片段序列分析和 ToxR 基因系统发育学分析 . 3 3 结果与分析 . 4 3.1 哈维氏弧菌 ToxR 基因的 PCR 扩增 . 4 3.2
9、 核苷酸序列测定和分析 . 4 3.3 氨基酸序列测定与分析 . 5 3.4 ToxR 基因进化树分析 . 6 4 结论 . 7 参考文献 . 8 1 1 前言 近年来在各种海水养殖动物中，海水鱼类的养殖在我国的发展势头最为迅猛；随着养殖规模的扩大，养殖密度的提高，养殖水体的恶化，水产养殖病害发生频繁。而目前生产上往往仅依靠大量使用抗生素暂时缓解病害的肆虐，然而这样做的直接后果是导致了耐药性菌株的不断出现，使得病害更加难以控制；另一方面药物残留严重影响了水质量。由此造成了养殖品种种质的退化和水产养殖品质量安全研究不到位，使得我国水产养殖品质和质量安全问题成为制约和影响养殖渔业可持续发展的主要瓶
10、颈。每年我国因病害造成的产量损失达数十亿元 1。由于该类疾病具有发病快，传播迅速，发病率及死亡率高等的特点，在微生物引起的鱼类疾病中危害最大，因而受到了国内外专家的关注。因此研究和调查鱼类细菌性疾病的流行病学，找出致病菌，研究致病菌的致病机理和发病条件，将为水产养殖病害防治提供可靠的理论基础；研 究准确、快速的诊断技术也将成为我国今后鱼类细菌病研究的重点。 哈维氏弧菌（ Vibrio harveyi）是一种革兰氏阴性、发光的海洋细菌，在海洋环境中分布广泛。最初哈维氏弧菌是在 1982 年美国巴尔的摩的国家水族馆中一头因患有血管炎而死亡的鲨鱼身上发现的，因而起初哈维氏弧菌被称为鲨鱼弧菌 2。后来
11、有人证明了哈维氏弧菌部分可以发光的菌株与鲨鱼弧菌是同一种菌。哈维氏弧菌是海水养殖动物的主要致病菌之一，在一定条件下，通过鱼体伤口感染，受到感染的病鱼的典型症状是眼部疾病（如角膜不透明、眼球突出和眼睛充血等），另外还 伴有伤口肌肉溃烂化脓、胃肠炎和败血症等症状，最终导致内脏器官的严重病变而使鱼死亡 2。哈维氏弧菌不仅宿主范围广，而且其弧菌病的发病率高，给海水养殖业带来了极大的威胁，并造成巨大的经济损失 3。尽管哈维氏弧菌是海水养殖动物的重要病原菌，但对其致病机制仍不十分清楚。因此，研究哈维氏弧菌的致病因子及哈维氏弧菌的快速检测技术，对鱼病的预防由重要的理论意义和实践价值。 ToxR 基因是在弧菌
12、家族中广泛分布的一种表达调控因子，对霍乱弧菌和副溶血弧菌的毒力基因表达起重要作用，并能促进创伤弧菌溶血素基因的表达，但哈维氏弧 菌的ToxR 基因是否对毒力基因有调控作用，目前尚不太清楚。本文利用 PCR 方法对哈维氏弧菌部分 ToxR 基因片段进行扩增，鉴定并对克隆的片段进行序列测定与序列分析，为哈维氏弧菌的致病机理研究和疫苗开发奠定基础。 2 材料与方法 2.1 实验菌株 哈维氏弧菌由本实验室分离保存。 2 2.2 仪器 本实验所采用的主要仪器和设备如表 1 所示 表 1 主要仪器和设备 名称型号 制造商或产地 5331 型 PCR 仪 eppendorf 天 能 3500 型凝胶成像系统
13、 BIO-BEST DYY-11 型电泳仪 北京市六一仪器厂 HS-200B 型恒温培养摇床 常州国华设备厂 ZD-600 型电热恒温水槽 宁波江南仪器厂 FRESCO-17 高速冷冻离心机 eppendorf 2.3 主要试剂 Taq DNA 酶、 dNTP、 10Buffer 等 PCR 反应试剂均购自 TaKaRa 公司；细菌基因组DNA 抽提试剂盒、 DNA 胶回收试剂盒购自上海生物工程技术有限公司；其他相关试剂均为国产分析纯。 2.4 培养基 TCBS 琼脂培养基：称取 8.9g，煮沸溶解于 100mL 蒸馏水中，冷却至 60 时，倾入无菌平板培养皿。无需高压灭菌。 Zobell 2
14、216E 液体培养基：蛋白胨 5g，酵母膏 1g，磷酸铁 0.01g，用 100mL 陈海水加热完全溶解，冷却后用 5%的 NaOH 溶液调 pH 为 7.6， 121 高压灭菌 30min。 2216E培养基可用以扩大培养弧菌。 2.5 哈维氏弧菌总 DNA 的提取 取超低温 冻存的 106 甘油菌一支，在 TCBS 平板上划线接种复苏， 28 培养 18 小时，选取单克隆菌落，用牙签挑取单个斑转接于 Zobell 2216E 培养基中， 28 ， 120r/min振荡培养 14 小时，取 1.5mL 菌液于 Ependoff 离心管中， 10000r/min 离心 30s，弃上清液，保留固
15、体；在离心管中加入 180L 的 Digestion Solution，使菌体重新悬浮，然后加入 20L 的 Proteinase K 混匀， 56 水浴 30min；加 200L 的 BD buffer， 70 水浴 10min；加 200L 的无水乙醇 混匀；将层析柱放入收集管中，把离心管中的溶液全部转移到层析柱中，室温放置 2min， 12000r/min 离心 3min，弃收集管中的液体；加入 500L 的 PW solution， 10000r/min 离心 1min，弃下层液体；加入 500L 的 Wash solution， 10000r/min离心 1min，弃下层液体； 10
16、000r/min 空离心 2min；将层析柱放到一个干净的 1.5mL 离3 心管，将预热好的 50L的 Elution Buffer滴到层析柱膜的中心， 60 水浴 5min， 10000r/min离心 1min；收集 离心管中的 DNA 作为 PCR 的模板， 于零下 20 保存。 2.6 ToxR 基因 PCR 扩增 根据 GenBank 上已登录的哈维氏弧菌 ToxR 基因编码序列设计 1 对引物，上游引物ToxR F1 (5-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3) ；下游引物 ToxR R2 (5-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3)。 PCR 反应总体系为 50
17、L，其中 10 buffer 5L、dNTP（ 25mmol/L） 4L、引物（ 5mol/L）各 1L、 TaqDNA 聚合酶（ 5U/L） 0.5L、DNA 模板 4L，双蒸水补足反应体系。 PCR 反应条件为： 94预变性 5min； 94变性45s， 54退火 30s， 72延伸 1min，进行 30 个循环； 72延伸 10min。 2.7 PCR 产物的测序 PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检验后割胶回收 ，并用 TaKaRa 公司的 PCR 产物凝胶回收试剂盒纯化， PCR 产物纯化步骤按说明书进行，即：在 PCR 反应液中加入 5 倍体积的 Buffer B3，充分混匀； 8
18、,000 g 离心 30 秒，倒掉收集管中液体；加入 500L Wash Solution， 9,000 g 离心 30 秒，倒掉收集管中液体；重 复一次上一步骤；空柱于 9,000 g 离心 1 分钟；将吸附柱放入一个干净的 1.5mL 离心管中，在吸附膜中央加入 15-40L Elution Buffer，室温静置 1 分钟后，离心 1 分钟，保存管中 DNA 溶液。纯化的 PCR 产物 送上海生工公司测序。 2.8 扩增片段序列分析和 ToxR 基因系统发育学分析 测序结果使用 DNAStar的 SeqMan进行序列比较拼接和裁剪。采用 NCBI上的 BLAST（ http:/www.n
19、cbi.nlm.nih.gov/BLAST/）进行序列相似性比较来初步确定所分离的哈维氏弧菌的分类地位 。从 GenBank下载 6条其他弧菌的全长或部 分 ToxR基因序列（表 2），使用 Bio Edit里的 Clustal W程序对其与扩增序列进行同源性分析。使用程序 Mega 4以基于距离的邻接法构建 ToxR基因系统进化树。 表 2 6 条 ToxR 基因序列的相应来源菌株和 GenBank 登录号 菌株 GenBank 登录号 4 哈维氏弧菌 Vibrio harveyi LPD 1-3-31 灿烂弧菌 Vibrio sp. SW-9702 溶藻弧菌 Vibrio alginoly
20、ticus isolate Va239 溶珊瑚 弧菌 Vibrio coralliilyticus strain S4053 坎氏弧菌 Vibrio campbellii strain CAIM 519T 副溶血弧菌 Vibrio parahaemolyticus isolate Vp252 FR719020 AY260170 EU155554 HQ452618 AY946038 EU155587 3 结果与分析 3.1 哈维氏弧菌 ToxR基因的 PCR 扩增 采用引物 F1 和 R2，对所提取的哈维氏弧菌的基因组 DNA 进行 PCR 扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，在 紫外线下可见扩增出的单
21、一电泳条带，其分子量为 400bp 左右（图1），结果符合预期扩增片段大小。 图 1 ToxR 基因 PCR 产物鉴定 注： 1.PCR 产物 PCR Products of ToxR gene 2.核酸分子质量标准 DNA Marker(DL 2,000) 3.2 核苷酸序列测定和分析 哈维氏弧菌 106 株的 ToxR 基因经上海生工公司测序，并通过生物软件分析，得到的 ToxR 基因的 DNA 序列及相应氨基酸序列如图 2 所示。 106 株基因全长为 384bp。其中 A、 T、 C、 G 四种碱基 的分布为 31.77%、 21.88%、 26.82%、 19.53%。与参考株 LP
22、D1331的 ToxR 基因的核苷酸及氨基酸序列几乎完全一致，只是由于目的基因的 172 位碱基发生移码突变，导致多编码了一个谷氨酰胺；而第 228 位和第 547 位碱基分别发生了同义突变（ T C， C A），所编码的氨基酸由异亮氨酸和丙氨酸变为苏氨酸和天冬氨酸。但两者的同源性还是非常的高，达到了 99%。说明该目的基因在两个不同来源株之间具有高度保守性，并证明了所扩增的序列为 ToxR 基因。但将该序列与 GenBank 中的其他五5 种弧菌比较同源性，则相差 较远。与灿烂弧菌的 ToxR 基因有 73%的同源性，与溶藻弧菌的 ToxR 基因有 78%的同源性，与溶珊瑚弧菌的 ToxR
23、基因有 66%的同源性，与坎氏弧菌的 ToxR 基因有 73%的同源性，与副溶血弧菌的 ToxR 基因有 77%的同源性，与其他弧菌的 ToxR 基因的同源性则相对更低。 图 2 哈维氏弧菌 106 株 ToxR 基因核苷酸及其编码的氨基酸序列 3.3 氨基酸序列测定与分析 利用 DNAStar 软件对所扩增的哈维氏弧菌部分 ToxR 基因序列进行分析，发现其编码一个由 116 个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白包含 32 个带电荷的氨基酸（ R、 K、 H、 Y、C、 D、 E）， 50 个极性氨基酸（ N、 C、 Q、 S、 T、 Y）， 28 个疏水性氨基酸（ A、 I、 L、F、 W、 V）
24、，富含亮氨酸。使用 MEGA 4 程序对该推导的氨基酸序列与在 GenBank 中查得的 6 条其他弧菌的 ToxR 蛋白序列进行多序列比对如图 3 所示，显示除了有少部分没变异，几乎全部氨基酸序列都呈现高度变异性。 NCBI 蛋白保守域搜索结果表明，该 ToxR 蛋白具有 DNA 结合位点的效应结构域，与双组分信号转导系统的应答调控蛋白同源（图 4）。一般认为， ToxR 蛋白包含与启动子 DNA 结合的胞质 转录激活区，跨膜区和环境感应因子刺激的周质区。由以上分析可知，不同弧菌 ToxR 蛋白的胞质转录激活区和周质区的保守程度不同。而介于胞质转录激活区和跨膜区之间的序列的变异性具有菌种特异
25、性，猜测其因为没有特殊的功能而具有较高的进化率造成。 6 图 3 不同弧菌 ToxR 氨基酸序列的多序列比对 图 4 推导的哈维氏弧菌 ToxR 蛋白的保守区域搜索 3.4 ToxR 基因进化树分析 对哈维氏弧菌及在 GenBank 中查得的其他弧菌的 ToxR 基因进行 系统进化树分析，进化树显示 ToxR 基因序列分辨 力较高，能在种的水平上很好的鉴别区分几种致病性弧菌；哈维氏弧菌在 ToxR 基因的进化树上与坎氏弧菌和灿烂弧菌这一支最为接近，这与这三种弧菌具有许多相同或相似的生化反应结果一致；哈维氏弧菌和副溶血弧菌与溶藻弧菌这一支在进化上也存在较密切的关系；而与溶珊瑚弧菌的分歧最大，可说两类弧菌间的关系非常少。值得关注的是，两株哈维氏弧菌在该进化树上分为 2 个群，说明哈维氏弧菌的 ToxR 基因在种内也存在较大的差异，在很大程度上有可能成为哈维氏弧菌分子分型的靶标基因（图 5）。但他们仍属同一家族，并且具有共同的祖先。
