1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物工程 鸡小肠 -葡萄糖苷酶的提取及性质研究 摘 要 -葡萄糖苷酶 广泛存在于自然界的所有生物体内，种类繁多，性质各异。 本实验用鸡小肠作原料，经过研磨，搅碎，制成粗酶液，在通过硫酸铵沉淀，透析，大孔树脂层析法提取 -葡萄糖苷酶。以 4-硝基苯 -D-吡喃葡萄糖苷为底物，研究酶催化反应动力学。结果表明，该酶的最适温度范围在 30 50 ，最适 pH范围在 6.06.5， -葡萄糖苷酶的热温度性较差。 Mg2+、 Zn2+、和 Fe2+对 -葡萄 糖苷酶有激活作用，而 Cu2+对 -葡萄糖苷酶有抑制作用。 关键词： 鸡小肠；提取；酶活力； -葡萄糖苷酶 AB
2、STRACT There are various -glycosidase of different features existing in all kinds of creatures. In this experiment chicken intestinal used as raw material is turn into crude enzymes by grinding, pulperring,and then crude enzymes is changed into precipitation through ammonium sulfate. At last by mean
3、s of dialysis and macroporous resin chromatography -glycosidase can be extracted. PNPG can be used to study Enzyme catalysis dynamics. The result suggests that this enzymes is active in temperature 30 50 ,pH6.06.5 but its hot temperature the gender is poorer. Mg2+、 Zn2+、 and Fe2+ have activation on
4、-glycosidase ,while Cu2+ has inhibitory action. Key words: chicken intestinal; enzyme activity ; extraction; -glycosidaseI 目 录 1 前言 . 1 2 材料与方法 . 2 2.1 仪器、药品、粗酶液、试剂的配制 . 2 2.1.1 仪器 . 2 2.1.2 药品 . 3 2.1.3 粗酶液的制备 . 3 2.1.4 磷酸缓冲液的配制 . 4 2.1.5 0.5mol/L Na2CO3 的配制 . 4 2.2 酶的提取 . 4 2.2.1 硫酸铵沉淀法 . 4 2.2.2
5、透析 . 4 2.2.3 大孔树脂吸附 . 4 2.3 标准曲线的制作 . 5 2.4 酶活力的测定 . 6 2.5 酶性质的研究 . 6 2.5.1 温度对 -葡萄糖苷酶的影响 . 6 2.5.2 金属离子对 -葡萄糖苷酶的影响 . 7 2.5.3 pH 对 -葡萄糖苷酶的影响 . 7 2.5.4 -葡萄糖苷酶的热稳定性 . 7 3 结果与分析 . 7 3.1 标准曲线 . 7 3.2 不同饱和浓度的 (NH4)2SO4 沉淀法 . 8 3.3 大孔树脂吸附法 . 8 3.4 酶学性质的研究 . 9 3.4.1 温度的影响 . 9 3.4.2 金属离子的影响 . 9 3.4.3 pH 的影响
6、 . 10 3.4.4 酶的热稳定性 . 10 4 结论与讨论 . 11 II 参考文献 . 11 1 1 前言 -葡萄糖苷酶（ -glycosidase，简称 -糖苷酶）是能够水解含糖苷键底物产生单糖的一类酶的总称。 -葡萄糖苷酶的相对分子质量一般在 400001500001.2。 不同来源的 -葡萄糖苷酶的相对分子质量差异很大。现在发现的所有 -葡萄糖苷酶的等电点 pI都在酸性范围，并且变化不大，一般在 3.05.0之间，但最适 pH值可以超过 7.03。 -葡萄糖苷酶的最适 pH多分布在 3.56.5，一般 -葡萄糖苷酶的稳定 pH范围超过 2个 pH单位 3。多数 -葡萄糖苷酶具有较高
7、的热稳定性和最适温度 4，不同来源的 -葡萄糖苷酶的热稳定性和最适温度有很大的差异。 -糖苷酶抑制剂可竞争性地抑制小肠内 -糖苷酶的活性，延缓或抑制葡萄糖在肠道内的吸收，从而有效地降低餐后血糖的峰值，调整血糖的水减少高血糖对胰腺的刺激，保护胰腺的功能。近年来的研究表明， -葡萄 糖苷酶抑制剂对预防和治疗糖尿病具有重要的作用 , 仅 -葡萄糖苷酶是一类能够从含 -糖苷键底物的非还原端催化水解 -葡萄糖基酶的总称，它可从低聚糖类底物的非还原末端切开 -1， 4糖苷键，释放出葡萄糖或将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成 -1， 6糖苷键，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖 5-7或糖酯、糖肽等 ,
8、它是现今开发 -葡萄糖苷酶抑制剂 类降糖药物的仿生实 中必不可少的原料之一，它是国外近年来积极开发的一种优良的功能型食品添加剂和保健食品基料 8。它具有预防龋齿等诸多的保健作用尤其是它能有效促进人体肠道内有益菌种 双歧杆菌的增值 9，但国内均来自进口 -葡萄糖苷酶是酶制剂中一类很重要的品种，它能切开麦芽糖和麦芽低聚糖 分子结构中 -1， 4糖苷键，并能将游离出来的一个葡萄糖残基转移到另一个葡萄糖分子或麦芽糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、潘糖等上。多数 -葡萄糖苷酶在化学本质上是一种糖蛋白，因来源不同。其分子中碳水化合物部分所占比例不同。在糖类底物的水解和转移反应中，糖苷键的裂 解发生在糖基的异头碳
9、和糖苷氧原子之间。糖基残基在水解反应中被水分子的质子取代，而在转移反应被来自受体的质子取代，即无论在水解反应还是在转移反应中都发生了糖基和质子间的交换反应。 -葡萄糖苷酶水解糖苷键时发生底物端基构型的保持或翻转产物的构型则由酶分子的构 型决定而与底物无关。 -葡萄糖苷酶的反应机理（见图 l） 10 2 图 1 -葡萄糖苷酶 反应机理 麦芽糖在 -葡萄糖苷酶的作用下水解，生成两分子的葡萄糖，游离出来的葡萄糖残基再被该酶转移到另一葡萄糖分子上，通过 -(1， 6)-葡萄糖苷键连接生成异麦芽糖。若受体为麦芽糖则生成潘糖。 -葡萄糖苷酶参与生物体的糖代谢，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用。酸性
10、-葡萄糖苷酶可催化麦芽糖和糖原降解对餐后血糖有明显影响。可以抑制体内 -葡萄糖苷酶的活性，防止餐后血糖的升高。 -葡萄糖苷酶在自然界广泛分布，种类繁多 ，几乎存在于所有生物体内，它在人类的糖基降解和动物 ,植物，微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。 工业上 -葡萄糖苷酶主要应用于低聚异麦芽糖的生产。另该酶还可应用于啤酒酿造，在糖化阶段加入，可改善啤酒口感，生产低醇保健啤酒；在发酵阶段添加，可生产低糖超级发酵度的清爽啤酒 11。可利用 -葡萄糖苷酶的转苷作用可以合成具有优良甜味的高甜度蛇菊苷衍生物，还可用于合成具有立体旋光性的糖脂及糖肽等。将 -葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶共固定化后制成生物传感
11、器可快速高效检测麦芽糖，从而应用于食品成分分析、医学诊断和环境分析 等方面。在医学上，除了熟知的作为 2型糖尿病治疗抑制剂筛选模型的主要反应试剂外，还可作为生化病理指标。如测定尿液中 -葡萄糖苷酶可辅助诊疗小儿肾小球疾病 12。 目前对于 -葡萄糖苷酶的研究比较多，但多数是关于微生物产 -葡萄糖苷酶的研究，而对于动物来源的 -葡萄糖苷酶研究不多，关于鸡小肠中的 -葡萄糖苷酶就更少了，本实验对鸡小肠 -葡萄糖苷酶进行提取和酶学性质研究，为后来的人对动物来源的 -葡萄糖苷酶的研究，打下来了良好的基础。充分研究 -葡萄糖苷酶的提取方法，以便从天然生物体中提取纯化 -葡萄糖苷酶，我 国天然资源丰富，为
12、我们提取 -葡萄糖苷酶提供了一个巨大的医药宝库 ,对降低实验成本，提高研究水平具有重要意义。 2 材料与方法 2.1 仪器、药品、粗酶液、试剂的配制 2.1.1 仪器 本实验主要使用仪器和设备如表 1 所示 3 表 1 主要仪器和设备 名称型号 制造商或产地 DS-1 高速组织捣碎机 上海标本模型厂 MC99-3 自动液相色谱分离层析仪 上海沪西分析仪器厂 NEOFUGE-23R 台式高速冷冻离心机 上海力康发展有限公司 HH-2 恒温水浴锅 常州国华电器有限公司 732PC 可见分光光度计 上海光 谱仪器有限公司 BS-224-S 电子天平 上海精密科学仪器有限公司 2.1.2 药品 本实验
13、使用的药品如表 2 所示。 表 2 主要药品试剂 药品名称 制造商或产地 对硝基苯酚 上海晶纯试剂有限公司 Na2HPO42H2O 天津市福晨化学试剂厂 NaH2PO4H 2O 天津市福晨化学试剂厂 Na2CO3 天津市通奇化工有限公司 NaOH 浙江中星化工试剂有限公司 HCl 浙江中星化工试剂有限公司 CuSO4 国药集团化学有限公司 KCl 宁波化学试剂厂 CaCl2 国药集团化学有限公司 MgCl2 国药集团化学有限公司 FeSO4 国药集团化学有限公司 (NH4)2SO4 天津市博迪化工有限公司 D-201 安徽三星树脂科技有限公司 乙醇 国药集团化学有限公司 2.1.3 粗酶液的制
14、备 本实验所采用的鸡小肠是来自于农贸市场，鸡小肠一定要是新鲜的， 先将买来的新鲜鸡小肠 ， 去脂，浆膜和内容物，冷冻，剪碎，组织匀浆 15 分钟，在将 匀浆液离心，去上清液，将磷酸缓冲液倒入该上清液中，制成粗酶液 13，放在 4 下保存，以待用。 4 2.1.4 磷酸缓冲液的配制 取 35.6gNa2HPO4 和 27.6NaH2PO4 分别定容至 1L,从定容的溶液中取 610mL Na2HPO4 溶液 390mLNaH2PO4 溶液混合配制成 pH 值 =7 的磷酸缓冲液。 2.1.5 碳酸钠 的配制 用电子天平称取 Na2CO35.3g，放在 100mL 的烧杯中溶解，再用玻璃棒引流到
15、100mL的容量瓶中，盖好瓶塞，以备后用 。 2.2 酶的提取 2.2.1 硫酸铵沉淀法 硫酸铵沉淀法 14可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉 淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 在 0 冰浴条件下，取 100mL 的粗酶液倒入烧杯，将称量好的 (NH4)2SO4 晶体慢慢倒入烧杯中，不停地搅拌，防止局部浓度过高而使酶液失活，待 (N
16、H4)2SO4 完全溶解时，停止搅拌，装入离心管中，用 10000 转 /分，离心半小时，有沉淀析出，收集沉淀，用磷酸缓冲溶液将沉淀溶解，测其酶活，并将剩余的酶液放在 0 冰箱保存。配制其 他浓度的 (NH4)2SO4 溶液按上述过程所述。各种浓度的饱和 (NH4)2SO4 配制 （见表 3）。 表 3 (NH4)2SO4 饱和度计算表（ 0 ） 饱和度 30 40 50 60 70 80 100mL所需克数 16.4 22.6 29.1 36.1 43.6 51.6 2.2.2 透析 透析：穿过膜的选择性扩散过程。可用于分离分子量大小不同的溶质，低于膜所截留阈值分子量的物质可扩散穿过膜，高于
17、膜截留阈值分子量的物质则被保留在半透膜的另一侧。 先将透析袋放在蒸馏水中煮 30 分钟，取 50%饱和硫酸铵中的酶液放在 透析袋中，将透析袋两头用绳子系住，并挂在玻璃棒上，玻璃棒横放在烧杯上面，在烧杯里面倒入磷酸缓冲液，盖没透析袋，发在 0C 环境中，每隔 3-6 小时换一次磷酸缓冲溶液，透析过夜，以彻底去除硫酸铵。 2.2.3 大孔树脂吸附 大孔吸附树脂 16是一类不含交换基团的高分子吸附剂。 其吸附性能与活性炭相似，5 其吸附性与表面作用和氢键有 关。大孔吸附树脂包含有许多网状孔穴结构，颗粒的比表面积大，具有一定的极性基团，使大孔树脂具有较大的吸附能力；同时其本身的多孔状结构又具有筛选作用
18、。因此，有机化合物根据吸附力的强弱及分子体积的 大小，吸附在一定规格的大孔吸附树脂上，经适当的溶剂洗脱可达到分离目的。 大孔吸附树脂主要以苯乙烯、廿甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈为原料加入一定量致孔剂二乙烯苯聚合而成的。因骨架材料不同可分为极性、中极性和非极性三种类型，非极性吸附树脂是由偶极距很小的单体聚合制得的不带任何官能团，孔表的疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部分的作用吸附溶液中的有机物；中极性吸附树脂系含酯基的吸附树脂，其表面兼有疏水和亲水两部分。极性吸附树脂是指含酰胺基，氰基，酚羟基等含氮、氧、硫极性官能团的吸附树脂，它们通过静电相互作用吸 附极性物质。大孔吸附树脂根据树脂孔径、
19、比表面积、树脂结构、极性差异等分为许多类型，在实际应用中，要根据分离要求加以选择。 树脂的预处理 16：先用电子天平称去 D-201 树脂 40g，放入烧杯用 95%乙醇浸泡一天，充分溶胀后，再用蒸馏水洗至没有黄色浑浊为止，再用 HCl浸泡一天，并用蒸馏水洗至中性，再用氢氧化钠浸泡树脂一天，再用蒸馏水洗至中性，并浸泡在蒸馏水中，以备待用。 装住：用玻璃棒不断搅拌烧杯中的树脂，让它均匀的分布在烧杯中，将浸在烧杯中的树脂慢慢倒入柱中，保证柱中的树脂不断层，打开柱子下面的皮管，使柱子 中的水留下来，等到树脂叠到离柱子顶端 12 厘米的时候，夹住下面的皮管，使液体流不下来，再拿蒸馏水倒入柱中与柱顶端平
20、。 测试：将酶液 2mL 倒入柱中，让树脂吸附，每隔一短时间，测流出液体的酶活，直到测出的吸光度开始变大时，再用洗脱液洗脱树脂，收集流出来的液体，测定酶活 17。 2.3 标准曲线的制作 称取 0.139g 对硝基苯酚，用 0.5mol/L Na2CO3 定容至 100mL，低温棕色瓶保存，此溶液为对硝基苯酚标准贮备液，然后依次移取对硝基苯酚标准贮备液 1mL、 2mL、 3mL、4mL、 5mL、 6mL 用 0.5mol/L Na2CO3 溶液定容至 100mL,配成浓度 100nmol/L、 200nmol/L、300nmol/L、 400nmol/L、 500nmol/L、 600nmol/L 的对硝基苯酚标准工作液 18（见表 4）。 取各浓度对硝基苯酚标准工作液 1mL,再加入 pH 值 =7 的磷酸缓冲液 3mL，所以试管 40 保温 15min 后加 2mL0.5mol/L Na2CO3 终止反应，摇匀后 420nm下测吸光度，以对硝基苯酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制成标准曲线。 表 4 标准曲线绘制
