1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物工程 南美白对虾虾尾在臭氧水处理条件下的 PPO和POD的变化 摘 要 本文主要研究南美白对虾虾尾在不同浓度臭氧水，不同的贮藏温度（ 0 、 4 、 10和 20 ）处理下，多酚氧化酶（ PPO）及过氧化物酶（ POD）随着时间的变化而变化。本次实验采用 3mg/L、 5mg/L、 10mg/L 臭氧水处理虾的尾部，并以纯水处理的虾的尾部为对照，分别提取粗酶，在紫外分光光度计下测得吸光度并计算多酚氧化酶（ PPO）与过氧化物酶（ POD）的酶活力。通过作图对比研 究发现 ，在较低温（ 0 ） 和较高温度（ 20 ） 时， PPO 和 POD 的最佳臭氧
2、水 保鲜浓度为 10mg/L； 在 4 时， PPO 和 POD的最佳臭氧 水 保鲜浓度为 5mg/L；在 10时， PPO 和 POD 的最佳臭氧 水 保鲜浓度为3mg/L。且温度越低，保鲜效果越好。同时，本文测定了多酚氧化酶（ PPO）的米氏常数 Km=17.14mmol/L，且以邻苯二酚为底物时， 南美白对虾的最适 pH为 6.0-7.0 之间。在 20 时虾尾的 PPO 活性最强，即最容易产生褐变。 关键词 ： 南美白对虾；多酚氧化酶（ PPO）；过氧化物酶（ POD）；臭氧水ABSTRACT This paper mainly studies the tail of Penaeus
3、vannamei Boone at different concentration ozone water and different storage temperature(0 ,4 ,10 and20 )processing,polyphenol oxidase(PPO) and peroxidase(POD) as time changes.This experiment used 5mg/L,3mg/L,10mg/L ozone water handle the tail of shrimp,and shrimp of pure water handle for comparison.
4、Extracted crude enzyme,respectively.Then,measured and calculated polyphenol oxidase(PPO) and peroxidase(POD) of enzyme activity under ultraviolet specrophotometer.Through comparative study found that the best ozone water preservation concentration of POD and PPO is 10mg/L in drawing a low temperatur
5、e(0 ) and high temperature(20 );At 4 ,the best ozone water preservation concentration of POD and PPO is 5mg/L;At 10 ,the best ozone water preservation concentration of POD and PPO is 3mg/L.And temperature is lower,the enzyme activity lower,preservation effect better.Meanwhile,the paper measured the
6、Michaelis constant of polyphenol oxidase(PPO),Km=17.14mmol/L,and with catechol as the substrate,the optimal pH of Penaeus vannamei Boone is 6.0-7.0 between. Key words: Penaeus vannamei; polyphenol oxidase (PPO); peroxidase (POD); ozone water I 目 录 1 前言 . 1 1.1 虾变黑的相关酶类介绍 . 1 1.2 新型的保鲜技术 臭氧保鲜 . 2 1.3
7、 研究的方法、目的及意义 . 2 2 材料与方法 . 3 2.1 实验材料 . 3 2.1.1 实验试剂 . 3 2.1.2 实验仪器与设备 . 3 2.2 实验方法 . 3 2.2.1 样品处理 . 3 2.2.2 米氏常数（ Km）测定 . 4 2.2.3 不同 pH 缓冲液对 PPO 活性的影响 . 4 2.2.4 不同温度对 PPO 活性的影响 . 4 2.2.5 POD 的活性测定 . 4 2.2.6 PPO 的活性测定 . 5 2.2.7 数据处理 . 5 3 结果与分析 . 5 3.1 米氏常数 （ Km）测定 . 5 3.2 不同 pH 缓冲液对 PPO 活性的影响 . 6 3
8、.4 不同浓度臭氧水对酶活的影响 . 7 3.4.1 不同浓度臭氧水对 POD 活性的影响 . 7 3.4.2 不同浓度臭氧水对 PPO 活性的影响 . 9 4 结论 . 11 参考文献 . 12 1 1 前言 近年来，我国对虾养殖业发展迅猛，产量由 1994 年的 6.39 万吨增至 2000 年 218万吨 1。对虾是一种味道鲜美、营养丰富、经济价值高的水产品，在人民生活水平越来越高的今天，得到了广大消费者的热烈欢迎，它具有蛋白质含量高、脂肪含量低的特点，已成为合理膳食结构中（不可缺少）的重要组分。在世界市场上，特别是在一些经济发达国家，虾类产品的需求量很高。 与畜禽类动物和其他一些水产品
9、相比，虾类极容易腐败变质，这是由于虾类捕捞后一般很快死亡，虾的头胸 部酶活性很强，微生物种类多。 酪氨酸或其衍生物等水溶性色原物质在酶的作用下被氧化形成黑色素 2。这类酶存在于甲壳类动物的血液及头、胸、关节和尾扇等黑变部位， O2 或紫外线是其反应的必要条件 3。 虾肉水分含量高，营养丰富，适宜腐败微生物的生长繁殖。且虾类的捕捞或收获期大多为微生物易于生长繁殖的高温季节，而且捕获量大，捕获点分散或远离收藏与加工点 4。所以，如何延长虾类的保鲜期，受到水产科学家和研究人员的关注。 1.1 虾变黑的相关酶类介绍 虾类变质的过程中伴随着体表黑斑的出现 ， 即 “ 黑变现象 ” ，黑变是甲壳类发 生变
10、质时在壳和肉之间的膜所发生的一种变化。这种反应曾经被认为是微生物的作用，但是现在被证明是一种酶促反应过程。这是由于虾体内存在大量地多酚氧化酶 （ polyphenol oxidase,PPO)。 PPO 能催化两类不同的反应，可以使一元酚羟基化，生成相应的邻二羟基化合物；也可以催化酚类上的羟基，使之转化为醌或催化多酚类变为氧合醌 6-8，因为醌类具有较强的电化学性质，会发生自动氧化、蛋白质的亲核聚合反应及一些二级反应，而这些反应都会导致酶促褐变反应的发生。影响 PPO 活性的因素有很多，包括温度、 pH、抑制剂等。 在 pH 值很大或很小的条件下，酶蛋白会变性而失活。酶活力中心常含有 -COO
11、H、 -NH2、 -SH、 -OH 等可离解的基团，这些基团的解离程度及其引起活力中心的结构与反应能力的变化是随介质 pH 值的变化而变化的。使用抑制剂是控制对虾褐变的有效途径。抑制剂分两大类，即竞争性抑制剂和非竞争性抑制剂。竞争抑制剂的结构与酶的正常底物相似，因此也能结合到酶的活力中心上去，生成酶 -抑制剂络合物；非竞争性抑制剂的结构和酶的正常底物并不类似，但它们也能和酶结合形成酶 -抑制剂络合物 9。例如，植酸、亚硫酸钠、抗坏血酸（ VC）都是很好 的 PPO 活性抑制剂。植酸是一种天然、低毒的保鲜剂，对金属离子有螯合作用（如有极强的螯合 Cu2+能力），能有效抑制酶活性。亚硫酸钠在酸性条
12、件下分解产生二氧化硫，二氧化硫能有效地使PPO 钝化，同时与醌发生不可逆反应生成无色产物。但使用亚硫酸钠存在食品安全问题。2 另一种抑制剂则是抗坏血酸（ VC），不同于亚硫酸钠， VC 并不存在食品安全的问题，VC 的作用机理是可阻止对虾中酪氨酸及其衍生物被氧化成醌类以及醌类进一步聚合成黑色素，从而抑制褐变；另外， VC 具有酸性，使溶液 pH 偏离 PPO 最适 pH，从而降低PPO 活性。这三种抑制 剂从效果来看，植酸抑制效果最佳，亚硫酸钠次之， VC 效果再差一点 10。 过氧化物酶（ peroxidase， POD） 是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶 ， 是以过氧化氢为电子受体催
13、化底物氧化的酶 。 主要存在于细胞的 过氧化物酶体 中 ， 以铁卟啉为辅基 ， 可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物 ， 具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。 其广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的、其结构和作用 机理不完全相同的一类含血红素的氧化酶，一般含有铁或铜等金属离子 11，具有多种生理功能。过氧化物酶（ POD）和多酚氧化酶 （ PPO） 一起被认为是引起褐变的主要酶类 。 POD 活性的上升参与酚类物质的氧化和聚合而导致褐变。二硫苏糖醇（ DTT）、抗坏血酸、柠檬酸、 FeSO4、 SDS、 ZnSO4，对 POD 活性均有不同程度的抑制作用。 1.2 新型的保鲜技术 -臭
14、氧保鲜 目前虾类的保鲜技术主要应用物理、化学、生物等手段对其进行处理，采取一些措施使酶钝化，微生物失活，以及使各种化学反应速度变慢甚至停止等等，从而保持或尽量保 持其原有的新鲜程度 12。目前应用于虾类的保鲜技术有低温保鲜、高压保鲜、气调保鲜、化学保鲜、辐射保鲜、生物保鲜等。各种保鲜技术都有各自的优缺点。 近年来，在我国食品安全问题凸显的情况下，研究无污染对人体无害的保鲜处理方法具有很大的意义。而臭氧技术处理食品符合这种要求，通过探讨臭氧在对虾保鲜上的应用为对虾的销售打开市场，同时对臭氧在其他水产保鲜作用的研究也有一定的鉴借作用。臭氧作为一种强氧化剂，其杀菌作用是通过与微生物细胞膜磷脂分子中的
15、不饱和脂肪酸或蛋白质发生氧化反应，从而达到杀菌作用，是一种广谱、高效、快 速的杀菌剂。臭氧消毒后分解为氧气，具有无毒、无害、无任何残留的特点，被广泛地应用于肉类、鱼类、家禽、乳制品、鸡蛋、水果、蔬菜和谷类等食品的防腐保鲜 13-15。 1.3 研究的方法、目的及意义 对虾由于其自身特点，肌肉组织较松软，组织蛋白酶的活性较强，自溶作用发生迅速，很快就会造成虾体新鲜度下降，腐败变质。此外酪氨酸或其衍生物等水溶性色原物质在酶的作用下易氧化成黑色素，从而引起虾体黑变。虾的变质和变黑都严重地影响其品质，降低了其商品价值。因此，研究对虾的保鲜，抑制其黑变，具有重要的现实意义。 本文主要的研 究目的是通过采
16、用不同浓度的臭氧水处理南美白对虾，记录其在不同3 保存天数下的 PPO 及 POD 的变化，计算酶活力，从而得出最适合对虾保存的臭氧水浓度。 2 材料与方法 2.1 实验材料 南美白对虾（购自宁波市场，保活运至实验室，剔除死亡个体，选择大小均匀、鲜活无损伤个体） 2.1.1 实验试剂 0.3%愈创木酚（用 50%乙醇配置）、 0.75%双氧水（现配现用）、二水磷酸二氢钠（天津市永大化学试剂开发中心）、十二水磷酸氢二钠（天津市博迪化工有限公司）、乙酸、乙酸钠、儿茶酚（ 邻苯二酚） ，以上试剂均为分析纯 2.1.2 实验仪器与设备 DF8520GL 实验室冷冻柜（赛普泰克有限公司）、 SPX-32
17、0 智能生化培养箱（宁波江南仪器厂）、 PP-20-P11 型 pH 计（德国赛多利斯集团）、 BS110S 电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）、移液枪、 HQ-40 实验室用制冰机（上海沪沁仪器设备有限公司）、 HH-4型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）、飞鸽牌 GL-20G- 低温冷冻离心机（上海安亭科学仪器总厂）、 UV-2000 型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司） 2.2 实验方法 2.2.1 样品处理 制备不同浓度的臭氧水以及 纯蒸馏水：纯蒸馏水两升； 3mg/L、 5mg/L、 10mg/L 臭氧水各两升。将 9.09kg 虾分装（ 1240g 4 桶），分别采
18、用 2L的纯水（对照组）、 3mg/L臭氧水、 5mg/L 臭氧水、 10mg/L 臭氧水连续处理 4 桶虾 20min。 准备四个智能生化培养箱，设置温度分别为 0、 4、 10、 20。 0 隔天 取一个样，共十组，即储存 20 天（处理 1、处理 2、处理 3 和对照组分别记作 25#、 26#、 27#、28#）； 4每天取一个样，共十组，即储存 10 天（处理 1、处理 2、处理 3 和对照组分别记 1#、 4#、 7#、 19#）； 10每天取一个样，共六组，即储存 6 天（处理 1、处理 2、处理 3 和对照组分别记 2#、 5#、 8#、 20#）； 20每天取一个样，共五组，
19、即储存 5 天（处理 1、处理 2、处理 3 和对照组分别记 3#、 6#、 9#、 21#）。其中以三只中等个头的虾为一个样本（约 40g），装入密封袋内（袋上留孔透气），做好编号，以方便取样。 取对虾 的 尾部 ，放于 0-4 环境下 ， 加入 5ml的 2M磷酸缓冲液 (0 ， pH6.5)研磨 ，称取 1g， 匀浆 ， 用纱布过滤。滤液在 12000r/min 下离心 10 min(提前将离心机预热至 4以下 )， 取其上清液 ， 即为 粗酶 ， 放入 0 -4 冰箱内备用。 4 2.2.2 米氏常数（ Km）测定 米氏常数（ Km）是酶的一个特征性物理量，其大小与酶的性质有关， 就是
20、指当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度 19。 Km值随测定的底物种类、反应的温度、 pH 及离子强度而改变。 现用 Lineweaver-Burk 双倒数作图法测米氏常数。以 0.1mol/L 的 pH6.0 磷酸盐缓冲液分别配制不同浓度 儿茶酚底物 溶液 ， 浓度梯度为 5mmol/L， 10mmol/L， 15mmol/L，20mmol/L， 25mmol/L。不同浓度的儿茶酚溶液与 0.2mL 的虾尾粗酶液在 30 反应，测定 PPO 活性。 根据 Lineweaver-Burk 双倒数作图法绘出动力学曲线，计算 Km值。 2.2.3 不同 pH 缓冲液对 PPO 活性的影响
21、 配制不同 pH 值的 0.1mol/L 磷酸缓冲溶液 （ pH 分别为： 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0）。在试管中，加入上述由不同 pH 值的缓冲溶液及 0.05mol/L 的邻苯二酚溶液 3mL，于 30恒温水浴锅中保温，接着分别加入 多酚氧化酶（ PPO）粗酶液 0.2mL，然后用分光光度计在波长 460nm 处测定其吸光值， 30s 记一次，记录三分钟内酶活变化，计算 得出多酚氧化酶活性（ PPO）。设置一个平行组。 2.2.4 不同温度对 PPO 活性的影响 准备试管，加入浓度为 0.05mol/L 的磷酸盐缓冲溶液（ pH=7.0） 1.5mL 和 0.1mol/
22、L的邻苯二酚溶液 1.0mL，分别在 0 、 10 、 20 、 30 、 40 、 50 下保温 5 分钟。然后将试管中的溶液移入比色皿中，分别加入虾尾 PPO 粗酶液 0.5mL，搅拌均匀后用紫外分光光度计（波长为 460nm）测其吸光值， 30s 记一次，记录三分钟内酶活的变化，得出多酚氧化酶的活性。设置一个平行组。 2.2.5 POD 的活性测定 将 0.2mol/L 的醋酸缓冲液（ pH5.4） 2mL 和愈创木酚 1ml 混合加入试管内，置于 30的恒温水浴锅中保温一段时间。然后加入到比色皿中作为底物溶液，并迅速加入 0.1mL的 H2O2 和 0.1mL 酶液，搅拌均匀， 于波长
23、为 460nm的紫外分光光度计上测定吸光值，记录 3 分钟内没酶活变化 ， 30s 记一次。（其中对照组为样品组中的酶液替换成醋酸缓冲液即可）。以每分钟光密度变化的 0.001 为一个活力单位（ U/gFW）。设置两个平行组。 酶活力计算公式： 酶活 = AVtWVs0.001t （ 1） Vt：加入缓冲液总体积 5 Vs：取样比色的体积 W：取样重 2.2.6 PPO 的活性测定 将 0.1mol/L 的磷酸氢二钠 磷酸二氢钠缓冲液（ pH6.5）配制的 0.05mol/L 邻苯二酚溶液作为酶底物。置于 30 的恒温水浴锅中保温一段时间，然后加入到比色皿中，并立即加入 0.2mL 的酶液，搅
24、拌均匀，于波长为 460nm 的分光光度计上测定吸光值。（其中对照组为样品组中的酶液替换成 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠缓冲液 即可）。酶活性以每分钟变化 0.002 光密度值（ OD） 为一个多酚氧化酶活力单位。设置两个平行组。 酶活力计算公式： 酶活 = AVtWVs0.002t （ 2） Vt：加入缓冲液总体积 Vs：取样比色的体积 W：取样重 2.2.7 数据处理 最后的酶活为三个数据得平均值，运用 Excel软件进行作图。 3 结果与分析 3.1 米氏常数（ Km）测定 根据 PPO 的反应特性， PPO 应符合米氏方程。即可表达为： V=Vmax S/(Km+S) Vmax 为最大反应速
25、率， S为底 物浓度，用 Lineweaver-Bark 双倒数法可求得 Km 值。 1/V=Km/Vmax1/S+1/Vmax 以 1/V 为纵坐标， 1/S为横坐标 作图。直线斜率为 Km/Vmax，截距为 1/Vmax。 本实验在 30水浴后，测定底物浓度的改变对酶活影响，采用 Lineweaver- Burk 双倒数作图法绘出 PPO 的动力学曲线如下： 6 y = 0 . 3 2 3 4 x + 0 . 0 1 9R2= 0 . 9 9 8 50 . 0 00 . 0 10 . 0 20 . 0 30 . 0 40 . 0 50 . 0 60 . 0 70 . 0 80 . 0 90
26、 . 0 4 0 . 0 6 0 . 0 8 0 . 1 0 0 . 1 2 0 . 1 4 0 . 1 6 0 . 1 8 0 . 2 0 0 . 2 21/S(L/mmol)1/V(min/units)图 1 PPO邻苯二酚反应的 Lineweaver-Burk 双倒数曲线 依图所示， Km=17.14mmol/L， Vmax=53（ units/min） 。 3.2 不同 pH 缓 冲液对 PPO 活性的影响 051015202530354 5 6 7 8 9pHPPO活性（units/min)图 2 pH 对南美白对虾 PPO 活性的影响 由上图可知，以邻苯二酚为底物，南美白对虾的最适 pH 为 6.0-7.0 之间。在 4.0-6.0之间时，酶活性随着 pH 值的升高而增加，其中在 pH值为 5.0-6.0 酶活性增加的速率更快，当 pH 值升高至 7.0 以上时，酶活性则随着 pH 增高而迅速降低。这可能是因为对虾PPO 是一种含铜蛋白质，其作用机理是铜还原作用。在 pH 值较低的酸性环境中，酶中铜因被解离而失活；在 pH 的碱性环境中，铜与酶蛋白脱离，成为不溶性氢氧化铜，也会使酶失活。对虾储藏过程中适当控制 pH 值，能明显减少褐变的发生。
