1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物工程 羊栖菜中岩藻黄质的提取工艺及其稳定性研究 2 摘 要 本文以冰冻羊栖菜为原料， HPLC 法检测岩藻黄质提取率为指标，研究了羊栖菜中岩藻黄质提取的最佳溶剂及工艺优化参数，并对产品稳定性进行试验。结果表明羊栖菜冰冻湿藻体中岩藻黄质提取的最佳溶剂配比 90%乙醇和丙酮体积比 3:1，液料比 4:1， 65水浴振荡提取两次，每次各 80min，得湿藻体岩藻黄质提取率为 1.067mg/g，粗产品得率 1.02%， 纯度约为 13.02% 。光照、温度及酸性条件对岩藻黄 质粗品贮存稳定性影响较大，氧化剂影响较小，表明岩藻黄质具有较强的抗氧化能力，不耐光、酸
2、及高温；在抗氧化剂存在条件下对岩藻黄质粗品贮存具有一定保护作用，因此，提示岩藻黄质粗品应注意低温、避光及酸性，并适当添加抗氧化剂条件贮存及运输，有利于岩藻黄质稳定。实验结果 为岩藻黄质色素产品开发提供了新的材料来源与工艺参考。 关键词 ： 羊栖菜；岩藻黄质；提取工艺；稳定性 3 Abstract Elect the best extraction process of fucoxanthin in Sargassum fusiforme by single factor experiment and orthogonal test,and take beam,oxidant(H2O2) ant
3、ioxidant（ VE） as study objects to research on the stability of fucoxanthin.The results show that the best extraction process of fucoxanthin in Sargassum fusiforme is that-90% ethanol and acetone mix together according to volume ratio 3:1,ratio of solvent is 4:1, water bath heat-treatment at 65 for t
4、wo times and 60min each time.Beam and acid all make the OD value of fucoxanthin extraction liquid reduce obviously, oxidant make the OD value of fucoxanthin extraction liquid reduce rarely. The OD value of fucoxanthin extraction liquid adding antioxidant hardly has change. Beam and have destructive
5、effect on fucoxanthin, fucoxanthin has inoxidizability to some extent.Antioxidant has protective effect on fucoxanthin. Key words: Sargassum fusiforme; Fucoxanthin; Extraction process; Stability 目录 目录 . 1 1 前言 . 1 1.1 羊栖菜的价值 . 1 1.2 岩藻黄质的概述 . 1 1.3 国内外研究现状 . 2 1.3.1 国外研究 . 2 1.3.2 国内研究 . 3 1.4 研究主要内
6、容及意义 . 3 2 材料与方法 . 3 2.1 材料 . 3 2.2 试剂 . 4 2.3 实验仪器 . 4 2.3 试验方法 . 4 2.3.1 羊栖菜岩藻黄质的提取工艺 . 4 2.3.2 岩藻黄质最大吸收峰确定及提取溶剂筛选 . 5 2.3.3 提取最佳工艺参数优化 . 5 2.3.4 岩藻黄质含量、提取率分析 . 5 2.3.5 贮存稳定性试验 . 5 3 结果与分析 . 5 3.1 岩藻黄质提取液的紫外扫描结果 . 5 3.2 高效液相分析岩藻黄质含量结果 . 6 3.3 提取溶剂的筛选 . 7 3.4 单因素对岩藻黄质提取率影响 . 8 3.4.1 复合溶剂配比 . 8 3.4.
7、2 温度 . 9 3.4.3 液料比 . 10 3.4.3 提取时间 . 10 3.4.4 提取次数 . 11 3.5 岩藻黄质最佳工艺条件确定 . 11 2 3.6 岩藻黄质粗品稳定性研究 . 13 3.6.1 光照对岩藻黄质稳定性的影响 . 13 3.6.2 氧化剂对岩藻黄质稳定性的影响 . 14 3.6.3 抗氧化剂对岩藻黄质稳定性的影响 . 14 3.6.4 酸对岩藻黄质稳定性的影响 . 15 3.6.5 温度对岩藻黄质稳定性的影响 . 16 4 结论与展望 . 16 参考文献 . 17 致 谢 .错误 !未定义书签。 1 前言 1.1 羊栖菜的价值 羊栖菜（ Sargassum fu
8、siforme） 属于褐藻门马尾藻科，又名海大麦、海栖菜。 它 是一种 暖温带一 亚热带 性 的 海藻， 其 主要生长在 太平洋 西北部。在我国沿海 ， 北自辽东半岛南到 广东 雷州半岛 有分布；在 日本 ，从 北海道南部经本州至 九州 均有；而 朝鲜沿 海 岸 (东岸、南岸及西南岸 )也 有羊栖菜的分布。 羊栖菜藻体肥厚多汁、营养丰富 、风味也很好 ,既可食用又能药用 ,具有较高的营养和药用价值。 经 研究发现 ， 羊栖菜 中 含有人体所需的 18种重要 氨基酸 （ 包括人体不能 自己 合成的 8 种必需氨基酸 )，以及 14 种重要 微量元素 ， 因此它 具有较高的营养保健价值 1。 中国
9、、日本、朝鲜和韩国沿海人民把羊栖菜 作为传统美食和中草药，推崇为海洋蔬菜和健康长寿品。在我国古代神农本草经和本草纲目中就对羊栖菜的药用价值进行了记载，而现代医学研究也表明：羊栖菜及其提取物中有多种抗肿瘤和改善人体免疫力的活性成分存在，对高血压、大肠癌等疾病均有一定疗效 2。虽然如此，但是我国天然的羊栖菜资源有限，远远不能满足开发利用的需求。过度采收会造成天然羊栖菜资源的巨大损失，目前通过采用人工培育养殖技术，缓解了这一现象，但是为了不浪费羊栖菜资源，更好地开发利用羊栖菜才是关键。 羊栖菜中含粗蛋白 7.95%,灰分 36.0%3，除 一些常见的脂肪酸与氨基酸外 ,岩藻黄质作为褐藻分类的特征物质
10、，使得褐藻体现出褐色。羊栖菜还含有叶绿素 a、c、 -胡萝卜素、岩藻黄质、叶黄素、褐藻淀粉、甘露醇、皂苷、褐藻酸及褐藻硫酸酯多糖等多种可利用成分 4。其中的岩藻黄质成分更是具有抗癌与减肥的良好功效被目前医药与保健领域广泛关注。 1.2 岩藻黄质的概述 岩藻黄质，亦称褐藻素、岩藻黄素，是褐藻、硅藻、金藻以及黄绿藻所含有的一种特征色素， 岩藻黄质属于类胡萝卜素的一种（其结构式见图 1-1）， 它参与光合作用的光化学系统，是使褐藻类呈现出褐色的主要物质，一般认为 岩藻黄质是褐藻所特有的色素。通常情况下在褐藻中，胡萝卜素的含量会高于叶黄素，而岩藻黄质含量比胡萝卜素和叶黄素的总和都要多 5。 2 图 1
11、 Fucoxanthin 结构式 岩藻黄质 （ fucoxanthin 结构式 C42H58O6） 的分子量为 658.91，密度 1.09，熔点166-168，它不溶于水，溶于某些有机溶剂，如石油醚、三氯甲烷等，易溶于乙醇。在偏酸性溶液、弱光和低温下比较稳定；在强碱、强光或高温条件下则容易被破坏，导致结构改变。岩藻黄质有很好的抗氧化性，但是光照条件下也很容易发生异构，从而失去其特 性。 由于岩藻黄质广泛存在于各种藻类、海洋浮游植物、水生贝壳类等动植物中 6，呈黄褐色，从甲醇中得红棕色晶体，色价高、抗氧化性强，作为一种功能性天然色素已引起人们广泛关注。国内外学者研究发现，岩藻黄质对人体及动物有
12、多种生理作用，如具有抗衰老、减肥、抗癌、神经细胞保护，增加小鼠体内的 DHA(二十二碳六烯酸 )和ARA(花生四烯酸 )的含量等功能 7-8。因此，岩藻黄质作为药物、保健品以及护肤美容产品的开发趋势在市场上显而易见，近几年从海带干粉中提取工艺研究有少量报道，但由于其抗氧化作用强，在提取率方面未达到 理想的效果；本文通过影响羊栖菜岩藻黄质提取工艺过程中温度、时间、液料比等主要因素优化，并从光照、氧化剂、温度、抗氧化剂和酸性条件方面对其贮存稳定性进行考察研究，旨在开发丰富的海洋资源，提高藻类羊栖菜附加值，并为其新型生产途径及工业化生产提供一定理论依据。 1.3 国内外研究现状 1.3.1 国外研究
13、 研究表明从长耳盒形藻提取的岩藻黄素对支气管细胞系和上皮细胞系具有抗增殖活性效应。以前也有发现 ,在 15 种可食用类胡萝卜素中，岩藻黄质特征结构 5 ,6 - 单环氧化物和烯键在抑制人类前列腺癌细胞生长繁殖方面效果 最好 9 。从裙带菜中分离出的岩藻黄质也可显著降低人类结肠癌细胞系 Caco - 2、 HT - 29 和 DLD - 1 的生存能力，并且认为：岩藻黄质与曲格列酮结合使用可作为结肠癌细胞的化学预防剂 10。最近，日本北海道大学研究人员通过对小鼠进行实验后发现，岩藻黄质可以通过两种方式来消除体内脂肪堆积 :(1)激活 UCP1 蛋白， UCP1 蛋白 可以促进脂肪分解，从而达到减
14、肥的效果； (2)刺激肝脏生成降低胆固醇含量的 DHA，所以岩藻黄质可成为很好的减肥药物 11。3 北海道大学研究人员证实岩藻黄质作为浓缩食品添加剂不会 引起实验动物的成瘾以及其它任何 副作用。 Kenji Shiratori 等研究表明 :岩藻黄质能抑制内毒素诱导性葡萄膜炎，其原理是通过阻断可诱导环氧合酶 -2 和一氧化氮合酶蛋白的表达从而达到的抑制葡萄膜炎的发生 。在本实验中，在眼部使用相同剂量的条件下其抗炎作用与泼尼松龙效果相当 12。还有许多研究已经表明，岩藻黄质是一种光辅助合成色素，且它具有多种生理作用。当它作为化学保护剂时，可抵抗由植物自身叶绿素的光敏氧化作用所引起的很多有害作用
15、13。 1.3.2 国内研究 目前国内对于褐藻黄素的研究报道不多，关于岩藻黄 质抗癌作用和减肥活性的研究，国内还尚未见到相关的报道，常见藻类中岩藻黄质含量的资源调查研究也很少。只有一些少数涉及提取方面的文章。岩藻黄质的开发也没有形成工业化，只是停留很初步的研究中，市面上只有纯度在 10%左右的岩藻黄素出售，而这些大多是销往国外作为进一步提纯的原料。目前国际市场上有关褐藻黄素的产品只有 LipoxanThin： 2006 年科学家终于从褐藻中提取出了高浓度的岩藻黄质，制成 LipoxanThin，这种药剂产品含有高浓度的岩藻黄质，大约为海藻中浓度的 500 倍。 LipoxanThin 目前已经
16、在美国与 其他地区销售，但价格昂贵，尚不能达到大 众消费水平 14。我国严小军等对产于青岛的四种褐藻进行了测定，研究得到在海 带科和翅藻科中岩藻黄质含量超过了类胡萝卜素的 50%，但是马尾藻科中，这一现象不明显 15。 1.4 研究主要内容及意义 羊栖菜对于我们应该不仅仅是一种食用海藻，深层的发掘其中的价值才是关键。现在我们已经发现了岩藻黄质的生理功能，而如何更好地开发利用这块资源很重要。优化岩藻黄质的提取条件提高其产量和质量，从而服务于所有需要的人们，发挥岩藻黄质的抗癌、减肥等作用。我国拥有丰富岩藻黄质资源，这为我们提 供了能够系统全面的研究以及合理开发阐述了其中的必要性和重要性的基础，同时
17、将为我们提供很多有价值而且重要的课题。 2 材料与 方法 2.1 材料 4 羊栖菜购于浙江省温州洞头县 5-6月新鲜藻体，清水 冲洗表面泥沙、盐粒，沥干后于 -20冰箱中 保存。实验前取冰冻藻体解冻，于真空冷冻干燥 ， 万能粉碎机粉 碎 ，过60目筛， 于 -20 冰箱中避光密封 保存备用。 2.2 试剂 岩藻黄质标准品 (sigma公司， 020M1541 )，甲醇、乙腈（色谱纯）， H2O2（ 30%），维生素 E(VE)， D101树脂（国产），其余实验所需试剂均为分析 纯。 2.3 实验仪器 表 1 实验 主要 仪器设备一览表 Table 1 List of experimental
18、equipment 仪器型号 型号 生产厂家 紫外可见分光光度 计 UV-3000 上海美谱达 高效液相色谱仪 Agilent-1100 美国 Agilent 高速万能粉碎机 FW100 天津市泰斯特 仪器有限公司 超级恒温水浴锅 DK-8D 上海齐欣 旋转蒸发器 FW100 上海沪西分析仪器厂 超声波细胞粉碎机 JY98- 宁波新芝生物科技股份有限公司 电子精密天平 BSA2245-CW 上海人和科学仪器有限公司 组织捣碎机 DS-1 上海标本模型厂 高速离心机 5804R 深圳市科美嘉仪器设备有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 OHG-907385- 上海新苗医疗器械制造有限公司 Thermo
19、离心浓缩 冷冻干燥系统 ModulyDD-230 VLP200 杭州雷琪实验器材有限公司 2.3 试验方法 2.3.1 羊栖菜岩藻黄质的提取工艺 称 取预处理羊栖菜 粉末 ，置于具塞三角瓶中，按比例加入提取溶剂，并外包裹 锡箔纸后， 120r/min 恒温水浴振荡加热提取 1h， 5000r/min 离心 10min，收集滤 液，在旋转蒸发器中真空浓缩至红褐色粘稠状，冷冻干燥成粉末粗品保存。 5 2.3.2 岩藻黄质最大吸收峰确定及提取溶剂筛选 羊栖菜按上述工艺用乙醇溶剂提取上清液稀释至一定浓度后与岩藻黄质标准品乙醇溶液，分别于紫外可见分光光度计中 350-700nm波长下扫描，确定岩藻黄质最
20、大吸收波长；平均称取等量羊栖菜 粉末 5 份 ,参考文献 (16)方法改进 ,分别选用不同极性的 5 种溶剂在相同条件下浸提，将上清液样品处理后直接用高效液相色谱仪测定岩藻黄质含量，比较提取效果。 2.3.3 提取最佳工艺参数优化 试验以岩藻黄 质提取率为响应值，选取影响羊栖菜岩藻黄质提取溶剂比、提取温度、时间、液料比进行单因素试验，并综合考虑各因素影响后，设计正交试验确定最佳提取工艺。 2.3.4 岩藻黄质含量、提取率分析 岩藻黄质含量检测参考文献 (17)方法改进，色谱条件： Hypersil ODS C-18 分析色谱柱（ Thermo， 4.6 mm 250mm5um）， UWD450
21、nm，柱温 30 ，乙腈 /甲醇 /0.1%醋酸铵溶液（ V/V 75:15:10），流速 1ml/min。将岩藻黄质标准品用无水乙醇配制成 1、 4、 8、16、 32ug/ml 系列浓 度， Agilent 1100 高效液相色谱仪检测分析 , 外标法定量。 羊栖菜经溶剂提取的上清液定容，过 0.45um 滤膜后上机分析，求出样品羊栖菜中岩藻黄质含量，并进一步计算羊栖菜中岩藻黄质提取率 (mg/g)。岩藻黄质提取率(mg/g)=m/M，其中 m样品溶液中岩藻黄质质量 (mg)， M样品液中羊栖菜藻体质量 (g)。 2.3.5 贮存稳定性试验 根据岩藻黄质与类胡萝卜素化合物性质相似性特点，试验参照 冯晓梅 18等番茄红素稳定性测定方法考察光照、温度、氧化剂、抗氧化剂、酸对羊栖菜岩藻黄质粗品稳定性的影响。 3 结 果与分析 3.1 岩藻黄质提取液的紫外扫描结果 称取约 5g 羊栖菜 粉末 及 适量 岩藻黄质标品于 100mL 锥形瓶，加入 100ml 90%乙醇，
