1、 本科毕业论文（设计）任务书 生物工程 中华鳖雄激素受体基因的克隆及生物信息学分析 1、研究目的和意义 中华鳖（ Pelodiscus sinensis）是我国重要的特种经济动物，其隶属于龟鳖目（ Testudinata）、鳖科（ Trionychidae）、鳖属（ Pelodiscus）。于其独特的食用价值和药用价值得到广大养殖户的青睐 11995 年中华鳖养殖业得到了空前发展，并形成全国性产业。但 1996 年中华鳖身价下跌，回落到 260 元 /公斤，稚鳖 12 元 /只销势仍缓慢。短短两年中华鳖市场饱和，越过上升期和成长期， 提前进入了衰退期。中华鳖养殖业的存在问题（ 1）中华鳖种苗退
2、化 ,中华鳖养殖业高额利润刺激了稚鳖的发展。众多养殖户一哄而上，形成千家万户都孵鳖的局面，导致种苗质量差、种苗退化等问题。如基础个体变小，病害增加等。（ 2）饲料 ,随中华鳖养殖业的迅速发展，鳖类动物鲜活饲料供应不稳定，故人工配合饵料应运而生，但他们对鳖营养生理的研究远远滞后于生产发展，加之有些厂家追求利润，饵料系数大大超过标准，导致市场上销售的鳖饲料相当部分营养不全，甚至添加一些激素等，导致鳖出现早熟、易发病等症状。这些给养殖户带来严重的不良后果。（ 3） 病害 根据有关文献记录，中华鳖疾病已有 30 余种，其中腐皮病、出血性肠炎、肋腺炎等发病率较高的疾病。仅 1995 年中华鳖商品鳖交易频
3、繁，各种疾病的流行在全国各地均有发生，其中温室养殖的发病率较高，发病面积为 30-50，死亡率为 20-50，部分养鳖场由此可见，鳖病严重威胁着我国养鳖业，它使养鳖业年经济损失达数亿元。 目前有关中华鳖的报道只局限在胚胎发育方面研究，分子生物学和生理学方面的研究尚未见报道。鉴于雄激素和 AR 在爬行类生殖内分泌调控中的重要意义，本论文通过分子生物学手段，克隆了中华鳖 AR cDNA 并进行 了序列分析， 对中华鳖 AR 基因的克隆将有助于中华鳖雄激素的认识，为阐明雄激素的作用机制提供了新的线索，并可以对 AR 基因的生物信息学提供进一步研究的基础， 期望对中华鳖AR 的分子生物学特征有更进一步
4、的了解 ，同时进一步研究与开发物种的基础生物学研究方面填补一定的空白。至今，全长雄激素受体 cDNA 已经在小鼠 2等哺乳动物的中成功克隆。在硬骨鱼类中，斑马鱼 3的 AR 基因已经成功克隆，根据它们的序列发现有较高程度的氨基酸保守性与功能结构域的相似性。本研究将通过这些已经克隆的硬骨鱼类 AR 基因克隆出中华 鳖的 AR，来加深对雄激素受体的认识，为全面阐明雄激素受体生物学信息，探讨 AR 的起源、进化、缺陷导致的病、育苗及饲料合成提供数据支持 。 2、主要内容与基本要求： AR 的起源与进化 1992 年 Laudet 等对不同的核受体进行系统分析表明，肾上腺受体和性类固醇受体区别于其他类
5、型的核受体成为一个独立的分支。在这些分支中， AR、 PR、 GR、MR 属于一个亚类群； ER 处于另一个亚类群。随着研究的深入， 1997 年 Baker 和 Escrivaetal 研究发现 AR 和 PR处于一个亚类群，而 GR 和 MR 处于另一个亚类群 。另外， 1997 年 Escriva 等在真骨鱼类和鲨类发现了 AR、 ER、 GR、 PR 的祖先分子，在盲鳗 Paramyxinenelsoni 则发现了 PR，而在无脊椎动物却没有发现肾上腺受体和性类固醇受体。 更有意思的是，他还在头索动物和尾索动物发现了雌激素相关受体，这就用实验支持了类固醇受体是一个近代的进化分支。接着，
6、在 2001 年 Thornton 等用七鳃鳗和所有已分离的类固醇受体构建的系统进化树表明， ER 是肾上腺受体和类固醇受体的祖先，并指出 PR 起源于 ER 的复制和分化，而 AR 则来源于 PR的复制。 AR的结构与功 能： AR是核受体超家族（ nuclear receptor super family）中的一员，是一种配体依赖性的反式转录调节蛋白。雄激素在细胞内与 AR结合后形成雄激素受体复合物，可进入核内，通过一系列受体后机制将细胞外的雄激素信号传导到 DNA上，调控特殊的基因表达，产生雄激素的生物效应。另外有研究表明，在 AR基因没有变异的情况下， AR的活化还可能通过配体非依赖的
7、方式进行。 AR配体非依赖性激活的方式有两种，一种是直接作用，改变 AR的结构及磷酸化状态：磷酸化的 AR可促进雄激素调节基因的转录；另一种是间接作用， 通过蛋白与蛋白之间的相互作用增强 AR的活性或减轻对 AR活性的抑制从而活化 AR。 AR基因一般由 4个结构域组成 : 低保守的氨基端结构域 (NTD)、高保守的 DNA 结合结构域 (DBD) 、铰链区以及高保守的羧基端配体结合结构域 (LBD) (如图 1)4。 不同的结构域具有特定的功能 : 图 1 AR 结构示意图 AR 的作用机制 睾酮、双氢睾酮等雄激素通过与雄激素受体结合而发挥作用。雄激素受体无活性时与 Hsp 结合，当雄激素通
8、过与受体结合，从而诱导 Hsp 解离，使 AR 发生一系列构象改变使其发生核转位 ，使 AR 在细胞核内二聚化，招募一系列共激活因子与 RNA 聚合酶 等形成转录增强复合体，通过与靶基因启动子 DNA 反应元件结合，调控细胞的转录程序，从而激活细胞内相关靶基因的转录 5。 图 2 雄激素受体作用机制 3、计划进度： 样品采集 2010.10 月 RNA 提取 2010.11 月 反转录及克隆 2010.12 月 生物信息学分析 2011.1-2 撰写论文 2011.3 4、主要参考文献： 1 陈光椿 ,卢建 .雄激素受体分子病理学研究进展 J.生命的化学 ,1997,17( 1) : 4244
9、. 2 Tilley W D, Marcelli M, Wilson J D, Mcphaul M J. Characterization and expression of a cDNA encoding the human androgen receptor.J Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86:327-331 3 Jgensen A, Andersen O, Bjerregaard P, et al. Identification and characterization of an androgen receptor from zebrafi
10、sh (Danio rerio)J. CompBiochem Physiol, 2007. 146: 561568. 4 Quigley C A， De BellisA, Marschke K B， et al. Androgen receptor defects: historical clinical and molecular PersPectives. Endocr Rev.1995.16(3):271-321. 5 Black BE, Pascha BM. 2004. Intranuclear organization and function of the androgen receptorJ. TrendsEndocrinol Met, 15: 411-417.
