1、 1 本科毕业论文外文翻译 译文： 在大肠杆菌中表达的白色念珠菌的 -葡萄糖苷酶的异源生化特性 来源： Antonie van Leeuwenhoek (2010) 98:291-298. Mara D. Frade-Perez Arturo Hernandez-Cervantes Arturo Flores-Carreon Hector M. Mora-Montes 摘要 ： 蛋白质糖基化作用是一个存在于真核细胞中的最常见的转录后修饰。 N-连接糖基化作用是一个寡糖的合成途径，通过这个途径可以 将寡糖到天冬酰胺残基网。此外 N-连接糖除了新生的蛋白质之外，还脱掉了最外层的一个 1.2-葡萄糖
2、单元的 N-连接的核心 Glc3Man9GlcNAc2.的 -葡萄糖苷酶。我们已经证实 -葡萄糖苷酶是正常细胞壁的组成成分，并且可以抗人类病原体白色念珠菌的活性。尽管这种酶对正常细胞很重要，但是我们很少了解它的结构和氨基酸参与的催还作用 。在这里，尽管缺少了来自 N-末端的 419个氨基酸，相应的 DNA片段对应最后 30 个白色念珠菌的片段 CWH41 和编码 -葡萄糖苷酶的基因，还是可以在细菌系统中得到表达并且重组的缩氨酸显示了 -葡萄糖苷酶的活动 。重组酶的生化特征表明在碳 3和碳 6上固定的羟基，在 C-2上的定位的氢氧基对葡萄糖的识别很重要。 此外，研究结果表明 ,半胱氨酸参与了重组
3、酶的催化作用 , 而非组氨酸残基。 关键词： 白色念珠菌；葡萄糖苷酶；糖基化；重组蛋白 前言 人类病原体细胞壁白色念珠菌是由内层的 -1.3 和 -1.6 葡聚糖，以及外层的甘露糖蛋白组成，甘露糖蛋白在粘附在宿主细胞和宿主免疫细胞和毒性识别具有重要作用。甘露糖蛋白是由 N-连接或 O-连接的葡聚糖和由甘露糖残基这些低聚糖组成的修饰，并用存在于酿酒酵母和白色念珠菌上。 N-连接糖基化途径用于在酿酒酵母和早期的人类细胞的保存。将 N-连接葡聚糖核心 G3M9 变成蛋白质这个过程发生在将肽运输到内质网后。然后， G3M9 低聚糖被内质网中的 -葡萄糖苷酶和糖蛋白转移到高尔基复合体中，其中的连接葡聚糖
4、核心进一步被高尔2 基体转移。这后面的步骤是由复合物，混合物或者高甘露 N-连接葡聚糖引起的。 -葡萄糖苷酶 1.2是内质网中的酶，其参加了 N-连接葡聚糖核心 G3M9过程。糖苷酶 1 被分在糖基水解酶 63 和 -1.2 葡聚糖单元 G3M9 生成Glc2Man9GlcNAc2。这中间是进一步处理 -葡萄糖苷酶 2，消除了最后两个 -1.3葡聚糖残基生产的 Glc2Man9GlcNAc2。与 -葡萄糖苷酶 1相反， -葡萄糖苷酶 2是酶 31与一个催化亚基 和一个结构亚基 形成的异二聚体。除了在 N-连接葡聚糖途径中起作用， -葡萄糖苷酶还参与了内质网相关降解，糖蛋白折叠的控制。在临床和微
5、生物领域中 -葡萄糖苷酶活动的重要性强调通过癫痫的发作来发现先天性糖基化 2的异常，肝肿大，是否是被组装病毒颗粒攻击后第一年而死的，当细胞不表达 -葡萄糖苷酶的活动时，则通过 抑制 -葡萄糖苷酶的活动和在植物形态发生畸变表达。 在真菌中， -葡萄 糖苷酶的缺陷与孢子的减少，隔膜的缺陷，极性生长和细胞壁的组成有关。 此外，在白色念珠菌的实验中，我们已经表明， 在所有健康的细胞中如果 缺少了 -葡萄糖苷酶的活动，细胞壁的装配和毒性上都有负面影响。 尽管我们对这些酶的生化特性有所了解，但对它的三维结构，催化氨基酸和参与底物结合的关键残基还是不甚了解的。为了对白色念珠菌活性的 -葡萄糖苷酶关键氨基酸有
6、所了解，我们表达了 CACWH41最后 3个基因，该基因编码的 -葡萄糖苷酶，在细菌系统证实了 -葡萄糖苷酶 1的末端对于酶的活性没有影响。此外，我们目前的证据表明， 半胱氨 酸， 参加了酶的催化作用 而不是 组氨酸残基。 材料和方法 化学品 蛋白胨和酵母提取物购自 Difco公司，氯化钠，羧苄青霉素，（ MUGlc），（ DNJ的），（ CNP）型的 N 乙基（ NEM）的，焦碳酸二乙酯（残留的 DEPC），2-脱氧葡萄糖， 3 -脱氧葡萄糖和 6 -脱氧葡萄糖为自 Sigma- Aldrich公司购买（圣路易斯，密苏里州）。异丙基 -的 D -半乳糖苷是由 Invitrogen公司（卡尔斯
7、巴德，加利福尼亚州），溶菌酶罗氏（印第安纳波利斯），及 Sephadex G- 25 自Pharmacia LKB 生物技术 （乌普萨拉，瑞典）。经 DEAE 生物凝胶 A 和电泳试剂均购自 Bio- Rad 公司实验室（大力士，加利福尼亚州）。所有其他化学品为纯度最高的市售的。 生物和培养条件 3 酶纯化，用 21500转数细胞匀浆离心 10分钟，可溶性部分用 DEAE生物凝胶 A柱与 10mol/L磷酸钠缓冲液， pH值 7.0平衡（ 1.8 20的厘米）的离子交换层析。 该柱用 40mL的 10mol/L， pH=7的磷酸缓冲液洗，样品经 100mL 的氯化钠在同一个缓冲液连续梯度洗脱。
8、 一毫升收集蛋白组分进行检测和酶活性的量化。小部分的 -葡萄糖苷酶活性用葡聚糖凝胶柱 ， 10mol/L的磷酸缓冲液， pH=7平衡。将大多数酶放在 -20 。该样本洗脱用 11mL 相同的缓冲液收集。 -葡萄糖苷酶检测 用荧光底物 MuGlc测定 -葡萄糖苷酶的活性。除另有注明外，反应混合物准备在 200l的容器里，有 10-100g的蛋白， 40g的 MuGlc和 10mol/L 的磷酸缓冲液， pH=7.0在 3.3mL50mol/L的甘氨酸氢氧化纳缓冲液， pH=11的环境下反应 30分钟，而荧光计 MU，激光和发射荧光分光光度计读取波长分别在 350nm和 440nm。 蛋白质的测定
9、，电泳和半变性酶谱 蛋 白用 Bradford法量化（布拉德福德 1976年），而其在色谱洗脱监测了 280纳米的光吸收。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS - PAGE电泳）是用12聚丙烯酰胺凝胶，并按照标准程序。揭示了蛋白质与考马斯亮蓝。 PCR 技术，使用从 CCAI4 白色念珠菌基因组 DNA 和引物对 50- CA 的CCTTCAAGACCATTTTTTCA- 30 和 50 TTATATCATTCATTGCAAATGT- 30（带下划线的基地表示为定向克隆接头序列）。在 1236 bp 的 PCR 产物克隆到pET100/D-TOPO 表达载体 （ Invitrogen 公
10、司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州），pCWH41Ct（图 1）。该质粒在大肠杆菌中的传播和维持 TOP10中一杆细胞，而大肠杆菌 BL21 StarTM（ DE3）中细胞用于基因表达如前描述（莫拉 -蒙特斯等，2008年）。 制备无细胞提取物和酶净化 在 LBC 中 37摄氏度培养 3小时的异丙醇的 BD -半乳糖苷细胞被离心收获，洗净，用 10mol/L 磷酸钠缓冲液， pH 值 7.0，悬浮在一个相同毫升含 50g/L 溶菌酶缓冲液， 37 孵育 12小时。细胞破碎完成了 5分钟，经过冷冻的溶菌酶孵育细胞，通过三个回合的 超声在 -70 下 20分钟。被染色的制备和半酶谱进行了变性如前所述，使
11、用 - 葡萄糖苷酶揭示溶液（ 10mol/L磷酸钠缓冲液， pH值 7.0，40m/LMUaGlc）。 4 结果与讨论 白色念珠菌的基因组按顺序排好，基因和蛋白质信息数据库是可利用的。CWH41.3eoc是在局部重叠群 Chr4_Ctg22121236 bp 的开放阅读框，并预计编码411个氨基酸的同源性有显着的一个 C-末端 47.8 kDa的蛋白 -葡萄糖苷我属于糖基水解酶家族 63。多肽没有任何潜在的胯膜结构域，其中包含 ELNVDLISW主题，参与了底物 的结合 .此外，残留 Arg47， Glu186， Asp190 和 Gly297 是同源Arg486来自人的 -葡萄糖苷酶 1，最
12、近 ，我们已经报道了整个 CACWH41的框架，有 2493bp包括了 CWH41.3，如上所述的 CACWH413的末端。这 830-氨基酸 96-kda蛋白被 CaCWH41编码，它是负责 50 %的 -葡萄糖苷酶活性在白色念珠菌中，她与内质网膜有关。 因为从 CaCWH413-端编码的产品含有对酶催化，即 ELNVDLISW 主题，Arg47， Glu186， Asp190和 Gly297最需要的氨基酸，我们确定 多肽是否有 -葡萄糖苷酶 活性 . 该 CaCWH413 -端是在大肠杆菌中表达为可溶性 447-氨基酸50 - kDa的 多肽，它在细胞中的存在依赖于诱导时间。对在 N-末端
13、的重组蛋白纯化标签，除了可能是考虑到其分子量增加，作为 411 - CaCWH413 末端 编码的氨基酸产品质量为 47.8 kDa的 预测。 纯化重组 Cwh41 C -末端 50 kDa的 重组 Cwh41 C -末端 表明 -葡萄糖苷酶对荧光底物 MUaGlc的活性。 虽然这种分子是不是为了一个共同的底物 -葡萄糖苷酶 1，在白色念珠菌我们以前已经证明 MuaGlc是一个有用的底物。 由于与重组蛋白的 N 端多聚组氨酸标签后，我们试图通过亲和层析柱纯化到镍琼脂糖。然而，重组酶是不可逆转的咪唑抑制，即使在低浓度中被使用，排除这一策略的使用净化。重组 -葡萄糖苷酶的分离纯化，而不是由阴离子交
14、换在经DEAE生物凝胶层析柱中，用连续的 NaCl梯度，酶的活性与 0.5 %氯化钠洗脱。进一步纯化的酶在一列经 Sephadex G-25，其中小肽和盐等被去除。 5 参考文献 1 Bause,Erkens,Schweden,Jaenicke(1986)Purification and characterization of trimm glucosidase from Saccharmyces cerevision.Febs lett206:208-212. 2 Bause, Schweden,Gross,Orthen B (1989)Purification and characteri
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