1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物工程 根霉与米曲霉原生质体一次基因组改组选育高酶活力菌株研究 摘 要 为了提高酒、酱油和酱类的生产效率，节约粮食，降低成本，本实验通过对根霉与米曲霉原生质体诱变后的筛选高酶活力菌株进行的原生质体制备、双亲灭活、融合、再生后代融合菌株。并对一、三、五、七代以及亲本在生长时的形态特征进行观察分析，且测了蛋白酶和淀粉酶的活力，最后对其进行 SDS 电泳分析。结果表明亲本和其杂交后代在培养基上生长都比较旺盛，菌体形状大多呈圆形，颜色逐渐加深，后代蛋白酶酶 的 活 力 普遍高于亲本，而淀粉酶的活 力 与亲本相似。例如：测蛋白酶 Hc 中亲本根霉 5%的显著差异为
2、c， 1%的显著差异为 C，米曲霉5%的显著差异为 c， 1%的显著差异为 BC，而融合三代 B5%的显著差异为 ab， 1%的显著差异为 AB,融合五代 A5%的显著差异为 a， 1%的显著差异为 A。淀粉酶中亲本与后代的 5%的显著差异基本为 ab， 1%的显著差异为 A。用 Tris 对菌丝提取蛋白质后进行电泳，发现后代的条带与亲本差异很大，说明后代与亲本存在一定差异。 关键词： 灭活；诱变； 原生质体 融合； 酶活 ； SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ABSTRACT In order to improve the wine, soy sauce and sauce production
3、efficiency, save food, reduce costs, the present study, and Rhizopus oryzae on Mutagenesis and screening of high enzyme activity after the strains of protoplast formation, parents killed, integration, Integration of renewable future strains. And one, three, five, seven generations, and parents in gr
4、owth was observed when the analysis of morphological characteristics, and measuring the protease and amylase, and finally its SDS electrophoresis. The results showed that parents and their offspring growth in the medium are relatively strong, mostly rounded cell shape, the color gradually deepened,
5、and their offspring alive protease enzyme is generally higher than in the parent, and amylase activity and parental similar. For example: measuring protease Hc in the parent Rhizopus 5% significant difference in the c, 1% significant difference in the C, Aspergillus oryzae 5% significant difference
6、in the c, 1% significant difference for the BC, and the integration of three generations of B5% significant Difference, ab, 1% significant difference for the AB, fusion A5% Five significant difference a, 1% significant difference in the A. Amylase in the parents and offspring significant difference
7、of 5% of basic as ab, 1% significant difference in the A. Extraction of the mycelium with Tris electrophoresis after the protein and found that offspring and parental bands very different generations and parents that there are some differences. Key words: Inactivation; mutagenesis; protoplast fusion
8、; activity; SDS-polyacrylamide gel electrophoresI 目 录 1 前言 . 3 1.1 研究现状 . 3 1.2 目的与意义 . 3 2 材料和方法 . 4 2.1 基因组改组 . 4 2.1.1 菌株 . 4 2.1.2 原生质体制备所需的酶类 . 4 2.1.3 培养基配置 . 4 2.1.4 试剂与仪器 . 5 2.1.5 主要溶液试剂及配制 . 5 2.1.6 其他材料 . 6 2.1.7 实验方法 . 6 2.2 传代培养 . 8 2.2.1 形态观察 . 8 2.2.2 酶活测定 . 8 3 结 果与分析 . 9 3.1 高酶活力菌株筛
9、选 . 9 3.2 后代形态分析 . 9 3.2.1 平板培养基观察结果 . 9 3.2.2 透明圈培养基观察结果 . 11 3.3 蛋白质含量分析 . 21 3.3.1 扫描图 . 21 3.3.2 蛋白质定量分析 . 22 3.3.3 定量检验报告表 . 22 3.4 蛋白质带分析 . 27 3.5 泳道中带分布报告 . 29 3.6 列相似性分析 . 31 3.6.1 相似性图表 . 31 3.6.2 亲本及其后代的聚类分析 . 31 II 4 小结 . 32 参考文献 . 33 3 1 前言 1.1 研究现状 原生质体融合技术 (Protoplast Fusion)是将遗传性状不同的两
10、个细胞融合为一个新细胞，使两亲株的整套基因相互重新组合的一种技术，属于细胞工 程。它是现代生化技术的一个分支， 起源于 20 世纪 60 年代 1。 1960 年法国的 Karski 研究小组在两种不同类型的动物细胞 的 混合培养中发现了自发融合现象 。 同时 ,日本的 Okada 发现并 证明了仙台病毒可诱发内艾氏腹水癌细胞彼此融合 ,从而开始了细胞融合的探讨 2。 现在原生质体融合技术在生产实践中的应用产生的效益。已是举世瞩目，它已成为高新技术开发的重要 领域。该技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生，基因定位、衰老控制理念等领域的研究都提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物
11、远缘杂交育种、发生生物学 、免疫医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值 3。通过原生质体融合进行细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。而且在兽医预防科学领域也已有原生质体融合的研究，主要目的是为了把不同免疫原性的菌株集中于同一菌株上，对血清型多而又元交叉免疫保护的病原菌研制多价疫苗时，有利于提高疫苗中单因子的单位抗原含量，达到提高免疫效果的目的 4。如于凤刚等研究禽巴氏杆菌双型融合株、禽巴氏杆菌与大肠埃希菌的双型融合株、禽大肠埃希菌双型融合株等。目前所进行的关于原生质体融合的研究仅仅局限于两个菌株之间的融合，没有扩 展到 3 个以上菌株之间的融合，如果我们能够开展多个菌株之间的融
12、合，则有可能获得同时具有多个优良性状的菌株，进一步拓宽这一技术的应用领域。 1.2 目的与意义 酿造产品利用微生物发酵在我国已有几千年的历史，但是普遍的纯粹培养以及诱变育种仅仅只有 20 多年的时间。 根霉在自然界分布很广，用途广泛，其淀粉酶活性很强，是酿造工业中常用糖化菌。我国最早利用根霉糖化淀粉（即阿明诺法）生产酒精。根霉能生产延胡索酸、乳酸等有机酸，还能产生芳香性的酯类物质 5。 米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降4 解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等 。 在蛋白酶的作用下，将不易消化
13、的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了 1000 多年。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达真核生物活性蛋白的载体 ， 米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。米曲 霉基因组的破译，也为研究由曲霉属真菌引起的曲霉病提供了线索。 根霉与米曲霉的优劣不仅直接影响酒、酱油和酱类的出品率，而且也关系到提高产品质量，食品卫生和风味的好坏，据不完全统计，我国每年用于酿造酱油几及酱类的粮食 1
14、0 多亿，如选择优良菌种提高利用率 2%就能节粮 2000 万斤，所以诱变育种是与酿造工业的发展、节约粮食和人民生活有着密切的关系 6。 2 材料和方法 2.1 基因组改组 2.1.1 菌株 根霉 (Rhizopus)、 米曲霉 （ Aspergillus oryzae） 。（均由万里学院提供）。 2.1.2 原 生质体制备所需的酶类 纤维素酶 (Cellulase)：购自上海伯奥生物技术有限公司 溶壁酶 (Lywallzyme)：购自广东微生物研究所。 蜗牛酶 (Snailase)：购自北京百泰生物技术有限公司。 2.1.3 培养基配置 马铃薯 固 体培养基（ PDA）：取一定量的马铃薯、洗
15、净、去皮、切块，称取100g 左右放入煮沸的蒸馏水中（约 500mL 左右）， 20min 后取浸出液，加入葡萄糖 10g， 琼脂粉 10g， 牛肉膏 2g，定容为 500mL 的 固体 培养基。 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 15g，琼脂 7.5g，淀粉 1g，加蒸馏水定容到 500ml。 酪蛋白水解培养基： Na2HPO47H20 1.07g， KH2PO4 0.36g，酪蛋白 10g琼脂粉15g，加蒸馏水定容到 1000mL。 以上培养基配置都为自然 pH 值，于 0.1Mpa 条件下灭菌 20min。 5 2.1.4 试剂与仪器 表 1 主要化学药品和试剂 名称 生产厂家
16、三（羟甲基）氨基甲烷 国药集团化学试剂有限公司 过硫酸铵 无锡市佳妮化工有限公司 甘氨酸 国药集团化学试剂有限公司 甲醇 中国杭州化学试剂有限公 无水乙醇 浙江中星化工试剂有限公司 丙烯酰 胺 国药集团化学试剂有限公司 N,N 亚甲基双丙烯 浙江中星化工试剂有限公司 SDS-PAGE 低分子量标准蛋白 中国科学院上海生物化学研究所监制 琼脂糖 华美生物工程有限公司 氯化钠 浙江中星化工试剂有限公司 表 2 主要仪器和设备 名称型号 制造商或产地 电子天平 BS210S 北京塞多利思仪器系统有限公司 PH 计 PELTA-320 梅特勒 -托利多仪器（上海）有限公司 冷冻离心机 Fresco 德
17、国 凝胶成像设备 Gel Doc EQ 日本 智能人工气候箱 RXZ 型 宁波江南仪器厂 电热恒温 鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司 立式自动电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂 超净工作台 SW-CJ-ICV 苏州安泰空气技术有限公司 全温振荡（空气）培养箱 上海福玛实验设备有限公司 恒温水浴锅 THZ 82 数显 常州国华设备厂 稳压稳流电泳仪 DYY 4 型 北京市六一仪器厂 2.1.5 主要溶液试剂及配制 （ 1） 30%丙烯酰胺贮存液 ： 称取丙烯酰胺 29g， 甲叉双丙烯酰胺 1g，加蒸馏水至 100mL，装于棕色瓶于 4 并向保存备用 ， （ 2） SDS-分离胶缓冲液
18、 ， 1.5mol/L Tris-HCL， pH 为 8.8，加入 0.4%SDS。 （ 3） SDS-浓缩胶缓冲液： 0.5mol/L Tris-HCL， pH 为 6.8，加入 0.4%SDS。 6 （ 4） SDS-电极缓冲液： 0.025mol/L Tris ， 0.192mol/L 甘氨酸 ， 0.1%SDS，pH8.3。 （ 5） 分离胶：配置比例为 10%，其中 10%SDS 0.4mL， 30%丙烯酰胺贮存液13.2mL， 10%过硫酸铵 0.4mL， 加水 16mL， 抽气后 ， 加入 TEMED21L， 迅速混匀倒入两玻璃板之间（占玻璃板高度的 2/3），上层用喷雾器覆盖一
19、水层，让其聚合 30min。 （ 6） 浓缩胶：配置比例为 5%，其中 10%SDS 0.1mL， 1MTris（ pH6.8）1.26Ml， 30%， 丙烯酰胺贮存液 1.66mL， 10%过硫酸铵溶液 100L ，加水 6.8mL，加入 TEMED15L ， 迅速混匀倒在制备好的分离胶上 ， 并插入样品槽模板，上层用喷雾器覆盖一水层，聚合 30min。 （ 7） Tris 提取液： 12.114g Tris 蒸馏水定溶到 100mL， 用 HCl 调节 pH 至6.87。 2.1.6 其他材料 移液枪 、 离心管、玻璃棒、烧杯、量筒、移液管、枪头、蒸馏水 、 一次性手套、 Molecula
20、r Imager GS-800 Calibrated Densitometer、 Quantity one 电泳分析软件等。 2.1.7 实验方法 （ 1） 菌种活化 将预先保留下来的两种菌种在超净工作台上分别接种到 马铃薯葡萄糖培养基上 ， 接种完成后倒置放于 30 恒温培养箱中黑暗培养 3-5d。 （ 2）菌丝制备 取已经活化好的两种菌种的平板，在平板中生成的菌落边缘全为白色的菌丝部分打 1mm 菌饼若干 ， 接种于马铃薯液体培养基中 ， 置于电磁恒温摇床中32 100r/min 条件下培养。 （ 3） 诱变 取 0.2ml 菌悬液 涂布完全培养基中，在紫外透射反射仪中 254nm 下进行紫外线诱变。照射时间设为 15min。照射后封盖黑布包裹置于 30的培养箱中黑暗条件下培养 36h6。之后放到选择培养基里培养，选取高酶活力的菌落。 （ 4）原生质体的制备与再生 菌丝培养：刮取培养基上生长旺盛的根霉与米曲霉孢子制得孢子悬液，取新
