1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物工程 南美白对虾虾尾在臭氧冰处理条件下的 PPO和 POD 的变化 摘 要 本文对不同浓度的臭氧冰在不同贮藏温度下对南美白对虾虾尾的保鲜效果进行了探讨实验，主要研究随着时间的变化，多酚氧化酶（ PPO）和过氧化物酶（ POD）的酶活的变化。并设置经 过纯冰 处理的南美白对虾虾尾与其对照。结果表明，在较低温 （ 0 ）时， PPO 和 POD 的最佳臭氧冰保鲜浓度为 3mg/L。 在较高温 （ 4 ， 10 ） 时， PPO 和POD 的最佳臭氧冰保鲜浓度为 5mg/L。且温度越低，酶活越低，保存的天数 越多，保鲜效果越好。 关键词： 南美白对虾虾尾；臭氧
2、冰；多酚氧化酶（ PPO）；过氧化物酶（ POD）；保鲜ABSTRACT This experiment on the preservation of decapitated Penaeus vannamei by the application of different concentrations of ozone ice at different storage temperatures was conducted. Mainly studies Prawns polyphenol oxidase (PPO)and peroxidase (POD)s activity changes a
3、s time changes compared with the decapitated Penaeus vannamei with pure ice treatment. The results show that 3mg/L ozone ice has the best preservation effect while at low temperature (0 ) wether PPO or POD; 5mg/L ozone ice has the best preservation effect while at high temperatures ( 4 and 10 ) weth
4、er PPO or POD. Also, lower temperature has lower enzyme live, can save the longer fresh days and has longer preservation time. Key words: decapitated Penaeus vannamei; ozone ice; polyphenol oxidase (PPO); peroxidase (POD); preservation I 目 录 1 前言 . 2 2 材料和方法 . 4 2.1 实验材料和仪器 . 4 2.1.1 实验材料 . 4 2.1.2
5、实验试剂 . 4 2.1.3 实验仪器 . 4 2.2 实验方法 . 4 2.2.1 原料预处理 . 4 2.2.2 溶液的配置 . 5 2.2.3 粗酶提取 . 5 2.2.4 不同 pH 缓冲液对 PPO 活性的影响测定 . 6 2.2.5 不同温度对 PPO 活性的影响测定 . 6 2.2.6 PPO 的米氏常数（ Km）测定 . 6 2.2.7 PPO 活性的测定 . 7 2.2.8 POD 活性的测定 . 7 2.3 数据处理 . 8 3 结果与分析 . 8 3.1 不同 pH 缓冲液对 PPO 活性的影响 . 8 3.2 温度对 PPO 活性的影响 . 8 3.2.1 不同温度下
6、PPO 活性的比较 . 8 3.2.2 PPO 的热稳定性 . 9 3.3 PPO 的米氏常数（ Km）测定 . 10 3.4 不同浓度臭氧冰对 POD 的影响 . 10 3.5 不同浓度臭氧冰对 PPO 的影响 . 12 4 结论 . 13 参考文献 . 15 1 前言 南美白对虾原产于南美太平洋沿岸的水域，其味道鲜美，营养丰富，深受消费者的喜爱。 20 世纪 90 年代初在我国引进养殖，现在该对虾的产量已经跃居国内三大主产经济对虾之首。但是，南美白对虾是易腐食品，很容易腐败而变质，特别在虾类死亡后 ,在酶类作用下所进行的无氧降解，使虾肉进一步降解至变质。虾类在贮 存期间的变黑、变质严重影响
7、了其外观品质和商品价值 1，所以，研究怎么延长虾类的保鲜期，具有非常重要的意义。目前，虾类的保存方法主要有冷藏和冷冻两种 2，冷冻虽然能有效的延长虾类的保鲜期，但是它会破坏虾类的蛋白质结构，影响虾类的口感；而冷藏则会给运输和储藏带来不便，加入化学物质的储藏，会给食品的安全带来隐患。 目前，科学家们在研究一种新型的水产品保鲜方法 臭氧及臭氧冰，臭氧水的保鲜方法。臭氧是一种强氧化剂，具有很强的杀菌，消毒，去臭去色等效果，其中以杀菌的效果最强。臭氧的杀菌作用，是物理，化学，生物学方 面的综合结果，它可以通过增强细胞膜的通透性，使细胞内物质外流，使细胞失去活力、也可以通过像细胞基础代谢酶和细胞合成必须
8、的酶等必须的酶失去活性、破坏细胞质内的遗传物质使其失去活性的方式杀菌。臭氧还具有果蔬保鲜的作用，臭氧不但能有效杀灭细菌和抑制真菌滋生，还可抑制呼吸作用，消除果实贮藏期间产生的乙烯、乙醇、乙醛等有害气体 3。臭氧的保鲜通过抑制和杀灭病原微生物和氧化有害代谢产物、消除农药残留实现的。臭氧还具有钝化酶活性，抑制蒸腾的作用。臭氧对对虾的多酚氧化酶 (PPO)具有抑制作用，据研究，臭氧能有效防止虾类黑 变，且其抑酶、防黑变效果均要比抗坏血酸和亚硫酸钠好。它可能通过以下途径影响酶活性：一、臭氧通过氧化部分酶蛋白使 PPO 失去活性产生钝化作用。二、臭氧延迟了 PPO 的激活，因为它一定程度上保护了质体，减
9、轻了其破坏度。三、臭氧可能部分阻断了酚类物质与 PPO 的接触，进而抑制了 PPO 的活性诱导。臭氧到底是通过其中一条途径或这些途径的综合作用来影响 PPO 的活性，还需要进一步的研究。虽然臭氧在水产品的保鲜中日益扩大，但是臭氧在常温下难以保存，使它在水产品的保鲜这项技术中一直没有进步。所以利用高浓度的臭氧制冰来保鲜水产品，不 仅可以起到冷却作用，还可以利用臭氧的强杀菌作用来杀减部分微生物，起到双重保鲜的作用。用臭氧冰保鲜水产品，保持了臭氧原有的性能和功效外，它的最大优点是保鲜作用好，使用方便，可以在任何场合和领域使用。可以预料，随着该领域研究的深入开展，臭氧冰保鲜将成为水产品保鲜的一条重要途
10、径 4。 虾类的变质主要和多酚氧化酶（ PPO）有关， 多酚氧化酶是自然界中分布极广的一种含铜金属酶类，大多数存在于细胞质中，也有的存在于细胞膜或细胞壁上。它可分为酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶、漆酶等三大类，多酚氧化酶可以催化两种不同的反应，一种是氧 化一元酚生成相应的邻二羟基化合物，第二种是邻 苯 二酚氧化，生成邻苯醌 5，迄今为止大多数研究都以邻苯二酚酶为主要对象。由于其能有效催化多酚类化合物氧化形成相应的醌类物质，因此被认为是导致酶促褐变反应的主要因素 6。 虾体内存在大量的多酚氧化酶（ PPO），能够使虾体表面产生双酚类物质，进而转变成有色的醌类物质，而醌类物质具有较高的活性，极易与氨基酸或
11、蛋白质结合成黑色素，从而导致虾的黑变。虾类黑 变 的研究主要是PPO 抑制剂的研究，该酶的抑制剂有两种：一种是与酶中 心 的铜起作用抑制酶的活性（如金属螯合剂）；另一种是通 过影响底物（如酚类化合物）与酶活性中心的结合部位进行作用而抑制酶的活性 7。植酸的防褐变效果最好，这主要因为多酚氧化酶是一种金属酶，它的活性中心具有铜离子，植酸与铜离子发生络合，进而使多酚氧化酶失去活性，从而抑制黑变反应的进行。同时植酸是一种酸性物质，根据对 PPO 的研究，酸性越低， PPO 的活性就越低，从而抑制酶促褐变的产生。 过氧化物酶（ POD）和多酚氧化酶 （ PPO） 一起被认为是引起褐变的主要酶类 ,广泛存
12、在于各种动物、植物和微生物体内 ，它是 结构和作用机理不完全相同的一类含血红素的氧化酶，一般含有铁或铜等金 属离子 8。 它能催化很多反应，是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，主要通过氧化双氧水或其它氧化物来氧化许多底物。主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基 ,可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。 POD 参与的生理活动很多，尤其在植物方面，它参与活性氧代谢过程，木质素和木栓质的合成，生长素的降解，还参与其它物质的氧化过程等 9。有研究表明， POD 可以催化氧化某些酚类物质，以某些方式参与了虾的褐变过程。 本实验将对经过不同浓度臭氧冰
13、处理的南美白对虾在不同保存天 数下的PPO 和 POD 的吸光值的变化进行记录，从而计算获得这两种酶酶活力的大小，通过比较对虾体内 PPO 和 POD 的酶活力大小来确定臭氧冰处理过的对虾的最佳保鲜浓度。本实验的研究，旨在探讨防止虾变质的最佳保鲜方法，以 加强 对虾的保鲜 效果 ，提高经济效益。 2 材料和方法 2.1 实验材料和仪器 2.1.1 实验材料 南美白对虾：购自宁波市场，保活运至实验室，剔除死亡个体，选择大小均匀、鲜活无损伤个体。 2.1.2 实验试剂 臭氧粉，乙酸 (醋酸 )，愈创木酚 （ 2-甲氧基酚 ） ，乙酸钠（醋酸钠），聚乙烯吡咯烷酮（ PVP），双 氧水（ H2O2），
14、十二水磷酸氢二钠，二水磷酸二氢钠，磷酸二氢钾，儿茶酚（邻苯二酚 ），乙醇 以上试剂均为分析纯 2.1.3 实验仪器 表 1 仪 器 仪器型号 生产公司 UV-2000 型紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司 BS110S 电子天平 北京赛多利斯天平有限公司 PP-20-P11 型 pH 计 德国赛多利斯集团 移液枪 德国 eppendorf SPX-320 智能生化培养箱 宁波江南仪器厂 DF8520GL 实验室冷冻柜 赛普泰克有限公司 HH-4 型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司 飞鸽牌 GL-20G- 低温冷冻离心机 上海安亭科学仪器总厂 HQ-40 实验室用制冰机 上海沪沁仪器
15、设备有限公司 2.2 实验方法 2.2.1 原料预处理 首先准备好不同浓度的臭氧冰以及纯水冰：纯水、 3mg/L 臭氧水、 5mg/L 臭氧水、 10mg/L 臭氧水各两升，装入制冰袋于冰箱制冰；然后将总量为 3.36kg 的虾分装成 4 个桶， 每桶 840g。每个样品准备好 3 只中等个头的虾（约 40g）， 3个一组装入密封的袋中（袋上留空透气），做好编号，方便取样；最后在虾处理的当天早上把冰打碎，装入 4 个大容器中，然后将分装好，标 记好的样品虾按编号马上放入 0 ， 4 ， 10 的恒温箱内。测样时 4 ， 10 每天测一个样， 0隔一天测一个样。具体见表 2。 I 组： 4 ，连
16、续做 10 天，即称取贮藏 ,10 天样品所需要的质量 （ g） 。 II 组： 10 ，连续做 6 天，即称取贮藏 6 天样品所需要的质量 （ g） 。 III 组： 0 ，做 10 天，隔天做，即称取贮藏 20 天样品所需要的质量 （ g） 。 表 2 南美白对虾分装处理表 样品组 处理条件 I 组 II 组 III 组 存储条件 D 桶 （ 840g） 3mg/L 臭氧冰2L， 20min （ 400g） 10# （ 240g） 11# （ 400g） 22# 0C 样品经臭氧冰处理后，就一直浸泡在臭氧冰中，放到 0C 的冰箱 ，其它的处理后放到对应温度冰箱 E 桶 （ 840g） 5m
17、g/L 臭氧冰2L， 20min （ 400g） 13# （ 240g） 14# （ 400g） 23# F 桶 （ 840g） 10mg/L 臭氧冰 2L， 20min （ 400g） 16# （ 240g） 17# （ 400g） 24# 空白桶 (840g) 纯冰处理 （ 400g） 19# （ 240g） 20# （ 400g） 29# 纯冰浸泡。放到 对应温度冰箱， 0C 样品一直浸泡在0C 的冰里于 0C 冰箱保存 2.2.2 溶液的配置 （ 1） 0.2mol /L pH5.4 醋酸缓冲液（ HAC:NaAC）：当溶液 pH5.4 时，两者的体积比为： 0.2M NaAc/mL:
18、0.2M HAC/mL=8.60:1.40。 （ 2）双氧水：（浓度为 0.75%，现配现用，一般在冰箱中可放 10d）。 （ 3）愈创木酚：（ 0.3%浓度，用 50%的乙醇配制）。 （ 4） 0.067mol/L pH7.2 的磷酸盐缓冲液： ：称取 KH2PO4 9.078g，用去离子水溶解定容至 1L。 ：称取 Na2HPO42H2O 11.876g（或 Na2HPO412H2O 23.894g）用去离子水溶解定容至 1L。然后将 和 按一定比例混合即可，调 pH 至 7.2。 （ 5） 0.1mol/L pH6.0 的磷酸氢二钠 磷酸二氢钠缓冲液：当溶液 pH6.0 时，两者的体积比
19、为 0.2M Na2HPO4/mL： 0.2M NaH2PO4/mL=12.3： 87.7。配好后，将溶液用去离子水稀释一倍。 （ 6） 邻苯二酚：用 pH6.0 的 0.1mol/L 的磷酸氢二钠 磷酸二氢钠缓冲液配制成 0.05mol/L。 2.2.3 粗酶提取 用电子天平称取 1g 的对虾 （ 取虾尾部分 ）， 放于 0-4 环境下 ,加入 5mL 0.067 molL- 1 磷酸缓冲液 （ 0 ， pH 7.2） 研磨 ,匀浆 ， 用纱布过滤（去除匀浆表层黄色的脂质） ， 滤液移入离心管 ， 然后置于已经预冷至 0-4 的高速冷冻离心机内 ，在 12000 rmin - 1 下离心 3
20、0 min， 取其上清液 ， 即为虾尾粗酶 ,放入 0 -4 冰箱内备用。 2.2.4 不同 pH 缓冲液对 PPO 活性的影响测定 首先配制出不同 pH 值的浓度为 0.1mol/L 磷酸缓冲溶液，缓冲液 pH 分别为 : 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0。在试管中，加入上述由不同 pH 值的缓冲溶液（已加入PVP）配制成的 0.05mol/L 的邻苯二酚溶液 3mL，然后于 30 恒温水浴锅中保温。接着移入比色皿中，分别加入虾尾 粗酶液 0.2mL，将邻苯二酚溶液和粗酶液搅拌均匀后用分光光度计在波长 460nm 处测定其吸光值， 30s 记一次，记录三分钟内酶活变化，得出多酚
21、氧化酶活性。 2.2.5 不同温度对 PPO 活性的影响测定 在试管中加入浓度为 0.1mol/L、 pH 值为 7.0 的磷酸盐缓冲溶液 1.5mL，0.1mol/L 的邻苯二酚溶液 1.0mL，分别于 0 、 10 、 20 、 30 、 40 、 50下保温 5 分钟。然后将试管中的溶液移入比色皿中，分别加入虾尾粗酶液 0.5mL，将比色皿中的溶液搅拌均匀后在波长为 460nm 的分光光度计处测其吸光值， 30s记一次，记录三分钟内酶活的变化，得出多酚氧化酶的活性。对于热稳定性的测定，分别将虾尾粗酶液在 20 、 30 、 50 、 60 、 70 、 80 条件下保温 1h,然后测定各
22、温度梯度下残余 PPO 活性。 2.2.6 PPO 的 米氏常数（ Km）测定 以 0.1mol/L、 pH6.0 磷酸盐缓冲液分别配制不同浓度的底物溶液（儿茶酚底物），浓度梯度为 5mmol/L, 10mmol/L， 15mmol/L， 20mmol/L， 25mmol/L。将 2.8mL不同浓度的儿茶酚溶液与 0.2mL 的虾尾粗酶液在 30 反应，测定 PPO 活性。然后用 Lineweaver-Burk 双倒数作图法绘出动力学曲线，计算米氏常数 Km 值，最大反应速率 Vm 值。 所谓米氏常数，它的数值等于酶促反应速度达到最大反应速 度一半时的底物浓度。它是酶的一个特征性常数，表示酶和
23、底物之间的亲和能力，当 Km 值越小，则酶与底物的亲和力越大，反应速率越快。反之亦然。 Km 值的大小与酶本身的性质有关，而与酶的浓度无关。 可用 Km 值鉴别不同的酶。 但是 Km 值会随着外因因素的改变而改变，如反应温度、 pH 值、测定底物等的不同而改变。因此，每个酶促反应在一定条件下都有它特定的 Km 值。 米氏方程，用来表示底物浓度与酶反应速度之间的量化关系，根据 PPO 的反应特性， PPO 应符合米氏方程。即可表达为： V=Vmax S/(Km+S) Vmax 为最大反应 速率， S为底物浓度，用 Lineweaver-Bark 双倒数法可求得Km 值。 1/V=Km/Vmax
24、1/S+1/Vmax 以 1/V 为纵坐标， 1/S为横坐标 作图。直线斜率为 Km/Vmax，截距为 1/Vmax。 2.2.7 PPO 活性的测定 以 pH6.0 溶液浓度为 0.1mol/L 的磷酸氢二钠 磷酸二氢钠缓冲液（已加入PVP）配制的 0.05mol/L 的邻苯二酚溶液作为酶底物。取每管 3mL 配好的邻苯二酚溶液分别装入试管内，预先置于 30 的恒温水浴锅中保温，然后将试管中的邻苯二酚溶液移入比色皿中，并 在每管测之前立即加入 0.2mL 的虾尾酶液，对照组中加入 0.2mL 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠缓冲液， 搅拌均匀，于波长为 460nm的分光光度计上测定吸光值，记录 3mi
25、n，每 0.5min 记一次。酶活性以每分钟变化 0.001 光密度值（ OD）为一个多酚氧化酶活力单位。 酶活力计算公式： tVsW VtA 001.0酶活 Vt：加入缓冲液总体积 Vs：取样比色的体积 W：取样重 2.2.8 POD 活性的测定 将 pH5.4 溶液浓度 0.2mol/L 的醋酸缓冲液 2mL 和 1mL 愈创木酚溶液 （ 0.3%浓度，用 50%乙醇 配制）混合加入试管内，预先置于 30 的恒温水浴锅中保温，然后将试管中的溶液移入比色皿中，并迅速加入 0.1mL 的 H2O2 （浓度为 0.75%，要现配现用，一般可在冰箱中存放 10D）和 0.1mL 虾尾酶液，对照组中加入 0.1mL H2O2 和 0.1mL 的醋酸缓冲溶液，在测之前加，将比色皿中的溶液搅拌均匀，于波长为 460nm 的分光光度计上测定吸光值。记录 3min，每 0.5min 记一次。以每分钟光密度变化的 0.01 为一个活力单位（ U/gFW）。
