1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物 技术 根霉与酵母原生质体一次基因改组后代酶活力和形态特性变化规律研究 摘 要 通过对酵母及根霉的原生质体融合，培养其融合 “二代 ”菌株。 通过传代培养多代后观察分析 “二代 ”菌株以及两真菌亲本的形态特征、部分生理生化特性，融合后代的根部特征产生匍匐枝，匍匐枝末端长有假根，趋向于根霉；融合后代产孢器官的大小多趋向于根霉。 通过对各融合后代的定量分析，后代的蛋白酶活普遍低于亲本，含量逐渐减少，且不稳定；其淀粉酶活与亲本根霉相似，后代含量稳定，但含量普遍低 于亲本。根霉CH 值 1.32，融合五代 E1 为 1.31，七代 B1 为 1.17，九代 B1
2、 为 1.11。 SDS 凝胶电泳后发现后代的 蛋白 条带数大多比亲本少，说明与亲本有一定的差异。 关键词： 根霉；酵母；原生质体融合；传代培养； SDS 凝胶电泳 ABSTRACT By means of protoplast fusion between yeast and rhizopus cultivate the fusion of “Second Generation”strains.After several subcultures observe the morphological characteristics and analyse physiological and bi
3、ochemical characteristics of the “Second Generation” strains and the two fungoid parent. The roots of convergence characteristics of offspring produced stolon, stolon end of the long a rhizoid tend to rhizopus. Future generations through the integration of quantitative analysis, their enzyme activit
4、y are generally lower the parent , and the content gradually reduce, it shows that the enzyme activity is unstable; on the other hand, the amylase activity is similar to parent with a stable content, but lower than the parent. The CH of rhizopus is 1.32, the fusion of 5 E1 is 1.31, the fusion of 7 B
5、1 is 1.17, the fusion of 9 B1 is 1.11. After the SDS gel electrophoresis found that the band of offspring less than their parents, there exist differences between generations. Key words: Rhizopus; yesst; protoplast fusion;subculture; SDS gel electrophoresis I 目 录 1 前言 . 1 1.1 研究现状及本研究的意义 . 1 1.2 本研究
6、的意义 . 1 2 材料与方法 . 2 2.1 材料、试剂和设备 . 2 2.1.1 材料 . 2 2.1.2 主要化学药品与试剂 . 2 2.1.3 主要仪器与设备 . 2 2.1.4 主要溶液试剂及配制 . 3 2.1.5 其他用品 . 3 2.2 实验方法 . 4 2.2.1 培养基 . 4 2.2.2 原生质体制备 . 4 2.2.3 原生质体融合 . 4 2.2.4 传代菌株筛选 . 5 2.2.5 菌丝扩大培养 . 5 2.2.6 蛋白质提取 . 5 2.2.7 菌种蛋白酶活力的测定 . 5 2.2.8 菌种淀粉酶活力的测定 . 5 2.2.9 SDS 电泳的方法 . 5 3 结果
7、与分析 . 6 3.1 后代形态分析 . 6 3.1.1 显微镜观察菌丝 . 8 3.1.2 孢子 . 10 3.1.3 孢子囊大小 . 10 3.2 亲本及融合后代蛋白酶的测定 . 12 3.3 亲本及融合后代淀粉酶的测定 . 17 3.4 SDS 凝胶电泳 . 21 3.4.1 扫描图 . 21 3.4.2 蛋白质定量 . 21 II 3.4.3 定量 检测报告 . 22 3.4.4 蛋白质带分析 . 26 3.4.5 泳道中带分布报告 . 27 3.4.6 列相似性分析 . 28 3.4.7 亲本及后代的聚类分析 . 29 4 小结 . 29 参考文献 . 30 致 谢 . 错误 !未定
8、义书签。 1 1 前言 1.1 研究现状及本研究的意义 原生质体融合 （ Protoplast fusion） 技术 指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程， 起源于 20 世纪 60 年代 1。 原生质体融合技术是将遗传性状不同的两个细胞融合为一个新细胞，通过原生质体融合技术使两个菌株的遗传物质得到重组，从而得到兼具两个亲本优良性状的新菌株 2。利用原生质体 融合技术不但可用于提高抗生素的产量，同时还可用于融合子产生新抗生素的研究，特别是链霉菌育种中 3。 1979年匈牙利的 Pesti首先提出了融合育种提高青霉素产量的报告，
9、开创了原生质体融合技术实际工作中的应用，使原生质体融合技术成为了工业菌株改良的重要手段之一 。 Hopwood4等提出，原生质体融合重组可能 使 实现隐形基因的重组暴露，产生新基因表达隐性的记忆，从而使成为链霉菌抗生素产生菌种的新途径。 在 1980 年举行的第六次国际发酵讨论会上，原生质体融合技术是大会讨论的主要内容之一，认为通过原生质体融合进行 基因重组的研究已经成为微生物遗传育种的一种有效的新工具 5。 原生质体融合是进行遗传育种研究的重要手段，也是获得菌种融合体和重组体的有效方法。但是亲本菌株遗传标记的诱变筛选较费时费力，而且会带来一些不良突变利用灭活原生质体作为供体进行融合是近年来选
10、育曲霉的重要方向 6。原生质体融合是进行遗传育种研究的重要手段，也是获得菌种融合体和重组体的有效方法。原生质体同样在病毒分子生物学中为研究病毒浸染、复制、基因组功能、病毒与寄主细胞的相互作用等提供了强有力的手段 7。 利用微生物处理污水是一个很有效的方法，许燕 滨 8等采用原生质体融合技术构建一株高效的降解含氯有机物工程菌，应用于造纸漂白废水。程树培 9等由单亲株灭活获得酿酒酵母与热带假丝酵母原生质体融合而成的杂交酵母细胞，净化味精废水，提高净水效率。 1.2 本研究的意义 在此技术上本实验对融合后的后代进行再生传代培养，并进行形态观察、酶活检测和蛋白质的 SDS 电泳，对结果进行分析并于亲本
11、对照，观察后代和亲本的相同之处和不同之处。如果本实验成功将会成为判断融合后代是否比亲本优异及融合后代稳定性的有力方法。 2 2 材料与方法 2.1 材料、试剂和设备 2.1.1 材料 菌种：酵母、根霉，酵母由王老师提供，根霉由何一鸣同学提供。 2.1.2 主要化学药品与试剂 表 1 主要化学药品和试剂 名称 型号 生产厂家 盐酸 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 十二烷基硫酸钠 分析纯 天津市北方天医化学试剂厂 甲叉双丙烯酰胺 分析纯 New Jersey， USA TEMED 分析纯 Sigma-aldrich， USA 丙烯酰胺 分析纯 New Jersey， USA 过硫酸铵 分析纯 温
12、州市化学用料厂 葡萄糖 优级 纯 国药集团化学试剂有限公司 浓硫酸 分析纯 溧阳市光 源工贸有限公司 琼脂粉 细菌级 杭州微生物试剂有限公司 蛋白胨 细菌级 杭州微生物试剂有限公司 磷酸二氢钠 分析纯 浙江临平化工试剂厂 磷酸氢二钠 分析纯 上海新华化工厂 干酪素 细菌级 杭州微生物试剂有限公司 甲醇 分析纯 北京北化福瑞化工有限公司 冰乙酸 分析纯 杭州高晶精细化工有限公司 2.1.3 主要仪器与设备 表 2 实验主要仪器表 名称 型号 生产厂家 双垂直电泳槽 HT-SCZ08 北京鸿涛 LS 立式压力蒸汽灭菌锅 LS-B150L 江阴滨江医疗设备有限公司 电泳仪 DYY-2C 北京市六一仪
13、器厂 电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9070A 上海精宏实验设备有限公司 续表 2 名称 型号 生产厂家 酸度计 InLab 梅特勒 -托利多仪器有限公司 3 Eppendorf 移液枪 Research SenYe Lab 显微镜 XS-212 南京江南光学仪器厂 台式高速冷冻离心机 Neofuge 13R 香港利康发展有限公司 智能人工气候箱 RXZ 江阴滨江医疗设备有限公司 双人单面超净工作台 SW-CJ-1B 苏州净化设备有限公司制造 电子天平 PL203 梅特勒 -托 利多仪器有限公司 恒温培养摇床 HY-1000 长沙湘仪离心机仪器公司 数显恒温水浴锅 HH-2 常州国华电器有限公司
14、 冰箱 BCD-219SKDC 青岛海尔股份有限公司 2.1.4 主要溶液试剂及配制 （ 1） 30丙烯酰胺贮存液：称取丙烯酰胺 29.2g，甲叉双丙烯酰胺 0.8g，加蒸馏水至 100mL，装于棕色瓶于 4 并向保存备用。 （ 2） 10过硫酸铵： 0.1g 过硫酸铵溶于 1mL 蒸馏水中。 （ 3）分离胶：配置比例为 10，其中 加水 7.9mL， 30丙烯酰胺贮存液 6.7mL，1.5mol/L Tris-HCl 5mL， pH 为 8.8， 10 SDS 分离胶缓冲液 200L， 10过硫酸铵200L，加入 TEMED25L，迅速混匀倒入两玻璃板之间（占玻璃板高度的 2/3），上层用喷
15、雾器覆盖一水层，让其聚合 3060min。 （ 4）浓缩胶：配置比例为 5，其中加水 5.5mL， 30丙烯酰胺贮存液 1.3mL，1mol/L Tris-HCl 1mL， pH 为 6.8， 10 SDS 分离胶缓冲液 80L， 10过硫酸铵溶液80L，加入 TEMED15L，迅速混匀倒在制备好的分离胶上，并插入样品槽模板，上层用喷雾器覆盖一水 层，聚合 30min。 （ 5） Tris 提取液： 12.114g Tris 蒸馏水定溶到 100mL，用 HCl 调节 pH 至 6.9。 （ 6） SDS 样品缓冲液： 50m mol/L Tris-Hcl（ pH6.8） ， 100m mol
16、/L DDT， 2%SDS，0.1%溴酚蓝， 10%甘油，与样品 1 比 1 混合 100 加热 10min。 （ 7）甘氨酸缓冲液： 0.025mol/L Tris， 0.192mol/L 甘氨酸， 0.1 SDS， pH8.3。 （ 8）染色液： 0.1%考马斯亮蓝 R-250， 40%甲醇， 10%冰醋酸。 （ 9）脱色液： 10%甲 醇， 10%冰醋酸。 2.1.5 其他用品 相机、 EP 管、 100mL 容量瓶、 离心管、玻璃棒、烧杯、量筒、移液管、枪头、 ddH2O、蒸馏水、一次性手套、溴化乙锭（ EB）、培养皿 、 Quantity one 电泳分析软件 等。 4 2.2 实验
17、方法 2.2.1 培养基 （ 1）马铃薯葡萄糖培养基（ PDA）：取一定量的马铃薯，洗净、去皮、切块，在电子天平上称取 100g 左右，与 500mL 的蒸馏水一起放入锅中，煮沸 20 分钟，用四层纱布过滤后取浸出液，加入葡萄糖 10g，琼脂 10g，酵母浸出汁 2.5g， 蛋白胨 2.5g， 溶解后加蒸馏水至 500 mL。 （ 2）酵母培养基： 5%葡萄糖 500mL 蒸馏水。 （ 3）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 15g，琼脂 7.5g， 淀粉 1g， 加蒸馏水定容到 500mL。 （ 4）酪蛋白水解培养基： Na2HPO47H20 1.07g， KH2PO4 0.36g，酪
18、蛋白 10g 琼脂粉 15g，加蒸馏水定容到 1000mL。 （ 5）马铃薯再生培养基：马铃薯 200g 洗净去皮，之后切片放入沸水中煮 20min，最后得到其浸出液，加 4.5g 琼脂（最终溶液含量为 0.9%），加入葡萄糖 20g 以及甘露醇和无菌水配制成 1L 的甘露醇浓度为 0.6mol/L 的混合溶液。以上培养基配置都为自然 pH值条件下于 0.1Mpa 条件下灭菌 20min 获得。 2.2.2 原生质体制备 根霉亲本原生质体制备：将培养好的根霉菌丝体培养液用四层擦镜纸过滤，根据离心管大小装入一定量的菌丝体到已灭菌的离心管中，以 1400rad/min 的低转速离心10min。之后
19、去除上清液。然后将沉淀移入另一个已经称量过的灭过菌的离心管内，封好进行称量。加入混合酶液后将菌丝和酶液充分混匀，放入适当的温度、转速为100rad/min 的摇床中酶解一定的时间。酶解完成之后将混合液用四层擦镜纸（已 紫外灭菌）过滤，接着将滤液装入 EP 管（已灭菌）以 6000rad/min 的转速离心 20min。之后取少许上清液在显微镜下进行观察，如没有原生质体说明原生质体已经完全沉淀了。此时可以将上清液去除，然后用渗透压稳定剂悬浮原生质体。 酵母亲本原生质体制备：在无菌室，将少量酵母倒入已灭菌的 5%葡萄糖溶液的培养瓶中，然后培养 5 到 12 小时，最后过滤出酵母，即可作为原生质体。
20、 2.2.3 原生质体融合 将根霉亲本原生质体紫外灭活 1 小时，酵母亲本原生质体热灭活 50 分钟， PEG 诱导融合，融合实验最佳 PEG（ 6000）浓度为 35，溶液 pH值为 7.5，融合率为 4.24，在融合后代中初筛选出 A1、 A2、 A3、 B1、 B2、 B3、 C1、 C2、 C3、 D1、 D2、 D3、 E1、E2、 E3、 F1、 F2、 F3、 G1、 G2、 G3、 H1、 H2、 H3。 5 2.2.4 传代菌株筛选 对初级筛选出的菌株进行蛋白酶、淀粉酶测定，取后代 B1、 D3、 E1、 F1、 G3、 H2样品进行传代培养，菌种保存，以及透明圈培养。 2.
21、2.5 菌丝扩大培养 将已接种到斜面培养基保存的 1、 3、 5、 7、 9 子代的每个样品 B1、 D3、 E1、 F1、G3、 H2 以及酵母和根霉亲本分别进行扩大 接种，接种到 PDA 平板培养基上，每个样品大约接种 3 到 5 个，在 28 恒温培养箱种培养 3 至 5 天，以保证有足够菌毛来获得电泳所需的蛋白质。并对子代 1、 3、 5、 7、 9 进行 菌落形态特征的观察，观察平板培养基上菌落蔓延状况、疏松程度，表面湿润或干燥，有无光泽，隆起形状，缘的整齐度、大小、颜色及镜检等。 2.2.6 蛋白质提取 用接种环将菌丝扩大培养的菌丝刮下，在 45 烘箱中烘数小时得到干燥的菌丝10-
22、11，取 0.1g 菌丝使用液氮研磨法充分研磨（研磨必须十分充分，防止蛋白含量不足导致电泳条带不明显），为保证获得足够蛋 白，在电泳之前可再次研磨样品，存放在 1mLEP管加 1mL Tris 提取液然后在 4 冷冻离心机 8000r/min 离心 20min，取上清液置于 4 冰箱中保存备用。 2.2.7 菌种蛋白酶活力的测定 对 1、 3、 5、 7、 9 每代的 B1、 D3、 E1 菌种除进行传代培养外，采用 “ 三点法 ” 接种至 酪蛋白水解培养基， 24、 40 小时观察透明圈，测量并记录其内外经长度。 2.2.8 菌种淀粉酶活力的测定 对 1、 3、 5、 7、 9 每代的 B1
23、、 D3、 E1 菌种除进行传代培养外，采用 “ 三点法 ” 接种于 牛肉膏蛋白胨培养基上， 24 小 时观察透明圈，测量并记录其内外经长度。 2.2.9 SDS 电泳的方法 制胶板的安装（短玻璃面朝内），要求密封，以免胶液泄漏。配制适量（如 20mL）的一定浓度的分离胶，将配制好的分离胶加入制胶槽中，注意应随着边缘缓慢加入，千万别进气泡。凝胶液加至距梳子齿 0.5cm处。轻轻在分离胶溶液上覆盖一层双蒸水封胶，使凝胶表面变得平整，静放 30min1h，使凝胶聚合 12。除去上面的水层，再用滤纸吸尽残留的液体。配制 5的浓缩胶（ 8mL）迅速将配制好的浓缩胶添加到分离胶表面，并将梳子插入凝胶内，至梳子齿的底部与前玻璃 板的顶部平齐，小心避免混入气泡。将凝胶垂直放置于室温下，约 30min 凝胶聚合 13。完成后将胶板染色脱色。 脱色完成后，将电泳得到的图谱通过 GS-800 Calibrated Densitometer 进行扫描，之后将得到扫描图运
