1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物 技术 根霉原生质体一次基因改组选育高酶活力菌株研究 摘 要 对两种真菌的灭活原生质体融合后代进行进一步的研究，经人工培养多代后观察菌株的形态特征、部分生理生化特性分析， 根 霉生长较快，且比较密集，融合后代 菌毛 很多；融合后代的根部特征产生匍匐枝，匍匐枝末端长有假根，趋向于根霉。通过 Quantity one 软件分析得到融合后代更趋近与亲本 根 霉。本实验对 亲本根霉、一代融合 根霉 1 号、根霉 2 号和根霉 3 号进行传代培养。并对一、三、五 代 、九代、十一 代 以及亲本 在 生长时的形态特征进行观察分析，且测了蛋白酶与 淀粉酶的活力，最后对
2、其进行 SDS 电泳分析。结果表明亲本和其杂交后代在培养基上生长都 一般 旺盛，菌体形状颜色都比较相似，但后代酶活普遍 都高 于亲本，例如： 通过测量透明圈的方法，得出淀粉 酶活力中亲本根霉 透明圈比为 1.75 而五代透明圈比则只有 2.086。用 Tris 对菌丝提取蛋白质后进行电泳，发现后代的条带大多比亲本 多 ，说明后代与亲本存在一定差异。 关键词： 根霉；原生质体； SDS 电泳 ABSTRACT Inactivation of the two fungi by protoplast fusion progeny of further study, after several gen
3、erations of artificial culture strains were observed morphological.Analyzed by Quantity one software, more generations are integrated with the parent Rhizopus.In this study of parental Rhizopus, Rhizopus generation of fusion 1, 2 and Rhizopus Rhizopus were subcultured 3. And one, three or five, nine
4、 generations, ten generations and the parents in growth was observed when the analysis of morphological characteristics, and measuring the protease and amylase, and finally its SDS electrophoresis. The results showed physiological and biochemical characterization of Rhizopus grew faster, and more in
5、tensive, the integration fimbriae many generations; the roots of convergence characteristics of offspring produced stolons, stolons with rhizoids end of a long, tend to Rhizopus that parents and their offspring are generally in strong growth medium, the cell shape of color are more similar, but the
6、offspring are generally higher than the parental activity, such as: the method by measuring the clear zone obtained in the parental amylase activity Rhizopus clear zone was 1.75 and the Five Dynasties and transparent than the circle than only 2.086. Mycelial proteins extracted with Tris after electr
7、ophoresis, the bands are mostly found in offspring than parents and more generations and the parents that there are some differences. Key Words: Rhizopus;Protoplasts;SDS gel electrophoresis I 目 录 1 前言 . 1 1.1 研究现状 . 1 1.2 本实验的研究目的与意义 . 1 2 材料与方法 . 2 2.1 材料、试剂和设备 . 2 2.1.1 材料 . 2 2.1.2 主要化学药品与试剂 . 2
8、2.1.3 主要仪器与设备 . 2 2.1.4 主要溶液试剂及配制 . 2 2.1.5 其他用品 . 3 2.2 方法 . 3 2.2.1 菌株活化 . 3 2.2.2 菌丝体培养 . 3 2.2.3 原生质体制备 . 4 2.2.4 原生质体融合 . 4 2.2.5 传代培养 . 5 2.2.6 菌种蛋白酶和淀粉酶活力的测定 . 5 2.2.7 SDS 电泳的方法 . 5 3 结果与分析 . 6 3.1 后代形态分析 . 6 3.2 不同菌种的蛋白酶和淀粉酶的活性测定和比较 . 7 3.3 SDS 电泳 . 15 3.3.1 扫描图 . 15 3.3.2 蛋白质定量 . 15 3.3.3 定
9、量检验报告 . 16 3.3.4 蛋白质带分析 . 18 3.3.5 泳道中带分布报告 . 19 3.3.6 列相似性分析 . 19 3.3.7 亲本及其后代的聚类分析 . 20 4 小结 . 21 II 参考文献 . 22 致 谢 .错误 !未定义书签。 1 1 前言 1.1 研究现状 根霉在 自然界 分布很广，用途广泛，其 淀粉酶 活性很强 ， 是酿造工业中常用糖化菌。我国最早利用根霉糖化淀粉（即阿明诺法）生产酒精。根霉能生产延胡索酸、乳酸等有机酸 ， 还能产生芳香性的酯类物质。根霉亦是转化甾族化合物的重要菌类。与生物技术关系密切的根霉主要有黑根霉、华根霉和米根霉。 除了细菌以外，根霉是迄
10、今为止丝状菌中产 L乳酸的另一重要菌种。根霉原生质体双亲灭活融合后代第 1-9代各后代的菌落、菌体形态特征的观察、分析 ， 通过对各后代蛋白酶活力、淀粉酶 活力 、 SDS电泳等多种方法测定、分析，同亲本相比较 ， 得出融合后代的形态特征、生理生化特性和稳定性等遗传特性和变化规律 1。 原生质体融合 (Protoplast fusion)技术 指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合 2， 借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程 ， 起源于 20 世纪 60 年代 3,5。 1960 年法国的 Karski 研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。
11、同时 ， 日本的 Okada 发现并证明了仙台病毒可诱发内艾氏腹水癌细胞彼此融合 ， 从而开始了细胞融合的探 讨 6,8。这项技术在高等动植物方面应用较早也很多 9， 在微生物育种方面则起步较晚 10， 但近年来国内外利用这项技术培育微生物良种比较活跃 ， 在方法上也有所进展。是一种新的有效的选育出优良品种的方法。 理论上讲体细胞杂交可在包括种内、种间、属间、科间甚至是界间的任何原生质体间进行 ， 原生质体融合技术不仅可以突破物种间的生殖隔离 ， 创造远缘杂种；同时还可以使双亲的细胞质基因结合在一起，从而达到改良由胞质基因控制的性状的目的 11。 在此技术上本实验对融合后的后代进行再生培养，并
12、进行形态观察、酶活检测和蛋白质 的 SDS电泳，对结果进行分析并于亲本对照，看看后代和亲本的相同之处和不同之处 12。 1.2 本实验的研究目的与意义 本实验的研究是原生质体融合技术的基础，同时也是关键的步骤 13。根霉经过 大量国内外科研人员的努力，在许多方面已经得以应用 14。现在 对根霉的灭活原生质体一次融合后代进行进一步的研究 15，经人工培养多代后 ,观察菌株的形态特征、部分生理生化形态分析以及的分析，为得到品种更优秀的，有利遗传。 2 2 材料与方法 2.1 材料、试剂和设备 2.1.1 材料 菌种：根霉 ，根 根融合菌株 1（以下均简 称 根 根 1）， 根 根融合菌株 2（以下
13、均简称根 根 2）， 根 根融合菌株 3（以下均简称 根 根 3），所有菌株均由老师提供。 2.1.2 主要化学药品与试剂 主要化学药品和试剂见表 1。 表 1 主要化学药品和试剂 名称 纯度 制造商 盐酸 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 甲叉双丙烯酰胺 分析纯 New Jersey,USAa 丙三醇 分析纯 天津市福晨化学试剂 过硫酸铵 分析纯 温州市化学用料厂 浓硫酸 分析纯 溧阳市光源工贸有限公司 正戊烷 分析纯 天津市大茂化学试剂厂 冰乙酸 分析纯 杭州高晶精 细化工有限公司 2.1.3 主要仪器与设备 主要仪器和设备见表 2。 表 2 主要仪器和设备 仪器 制造商 RXZ 型智能人
14、工气候箱 江阴滨江医疗设备有限公司 PB203-N 型电子精密天平 宁波江南仪器厂 HH-2 数显恒温水浴锅 梅特勒 -托利多仪器（上海）有限公司 电子万用炉 常州国华电器有限公司 酸度计 梅特勒 -托利多仪器（上海）有限公司 DYY-6C 型电泳仪 北京市六一仪器厂 多功能电磁炉 广东美的生活电器制造有限公司 2.1.4 主要溶液试剂及配制 （ 1） 30丙烯酰胺贮存液：称取丙烯酰 胺 29.2g，甲叉双丙烯酰胺 0.8g，加蒸馏水至 100mL，装于棕色瓶于 4 并向保存备用。 （ 2） SDS-分离胶缓冲液： 1.5mol/L Tris-HCl， pH 为 8.8，加入 0.4 SDS。
15、 3 （ 3） SDS-浓缩胶缓冲液： 0.5mol/L Tris-HCl， pH 为 8.8，加入 0.4 SDS。 （ 4） SDS-电极缓冲液： 0.025mol/L Tris， 0.192mol/L 甘氨酸， 0.1 SDS， pH8.3。 （ 5）分离胶：配置比例为 12.5，其中 SDS-分离胶缓冲液 4.5mL， 30丙烯酰胺贮存液 7.5mL， 10过硫酸铵 60L，加水 6mL，抽气后，加入 TEMED30L， 迅速混匀倒入两玻璃板之间（占玻璃板高度的 2/3），上层用喷雾器覆盖一水层，让其聚合 30-60min。 （ 6）浓缩胶：配置比例为 5，其中 SDS-分离胶缓冲液
16、4.5mL， 30丙烯酰胺贮存液 1.5mL， 10过硫酸铵溶液 15L，加水 1mL， 加入 TEMED15L，迅速混匀倒在制备好的分离胶上，并插入样品槽模板，上层用喷雾器覆盖一水层，聚合 30min。 （ 7） Tris 提取液： 12.114g Tris 蒸馏水定溶到 100mL，用 HCl 调节 pH 至 6.9。 2.1.5 其他用品 移液枪、离心管、玻璃棒、烧杯、量筒、移液管、枪头、 ddH2O、蒸馏水、一次性手套、溴化乙锭（ EB）、 TEMED、 Quantity one 电泳分析软件 等。 2.2 方法 （ 1） 分别用 5mm 接种棒根霉亲本、黑根 1 一代、 根 根 2
17、一代、 根 根 3 一代的培养基上打 3 个孔，将 3 个孔所包含的菌种接种到各自的培养基上，放置于 28 培养箱中进行培养 1 天 ，即一代， 1 天 后把各个菌种接种到另一个无菌的培养基上培养，如此反复，培养至十代。 （ 2）培养好的子代进行 菌落形态特征的观察，观察平板培养基上菌落蔓延状况 、疏松程度，表面湿润或干燥，有无光泽 ， 隆起形状 ， 边缘的整齐度、大小、颜色等。 2.2.1 菌株活化 在无菌环境下，将已灭菌的 PDA 培养基倾入灭过菌的培养皿中，制成平板；待其冷却凝固后 ， 用无菌接种针蘸取少量保藏的根霉菌种，接种于平板上，倒置于 30 恒温培养箱内，培养 5 天。 2.2.
18、2 菌丝体培养 于无菌室的无菌环境下，在酒精灯火焰旁 ， 将液体培养基分装入灭过菌的培养瓶中并标号。将活化好的菌株接种入已经灭过菌的盛有约 30mL液体菌丝培养基的摇瓶中（菌丝大小不限，只要用接种针在培养基表面菌落处轻轻蘸取一下即可，每次 接种后接种针均要在酒精灯火焰中灭菌并冷却才可挑取下一个菌丝）。之后放入 30 ， 转速为120rad/min 的摇床内培养 16-18h。 4 2.2.3 原生质体制备 将培养好的菌丝体培养液用四层擦镜纸过滤 ， 根据离心管大小装入一定量的菌丝体到已灭菌的离心管中 ， 以 1400r/min 的低转速离心 10min。之后去除上清液。然后将沉淀移入另一个已经
19、称量过的灭过菌的离心管内，封好进行称量（菌丝的移动和菌丝的接种 ， 还有上清液的去除等等材料有机会接触外界环境的情况下，这些操作都要在无菌的条件进行）。 酶解液的体积按照以下方法来换 算：菌丝重量的 1.5 倍就是酶解液的量 ， 酶解液为混合酶液，蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶以一定的浓度混合，用渗透压稳定剂配制而成。酶液的配置要当天配当天用。一是为了防止酶的失活，二是防止对量的估计不足而造成浪费。酶液的配置要在无菌条件下配置防止有杂菌的进入 ， 最后影响试验的结果。加入混合酶液后将菌丝和酶液充分混匀 ， 放入适当的温度、转速为 100rad/min 的摇床中酶解一定的时间（每分钟 40100 转的
20、震荡不仅可以加快原生质体的释放 ， 使达到最大的原生质体形成率的时间缩短 ， 有利于提高再生率 ， 而且可以抑制孢子的萌发 ， 有利于 原生质体的形成）。 酶解完成之后将混合液用四层擦镜纸（已紫外灭菌）过滤 ， 接着将滤液装入 EP 管（已灭菌）以 6000r/min 的转速离心 20min（由于原生质体小而轻所以一定要高转速才能让原生质体沉淀下来）。之后取少许上清液在显微镜下进行观察 ， 如没有原生质体说明原生质体已经完全沉淀了。此时可以将上清液去除（即将酶液去除 ， 酶液的去除要尽快 ， 否则会使酶解过程过度 ， 从而造成原生质体的破裂 ， 影响原生质体的形成） ， 然后用渗透压稳定剂悬浮
21、原生质体。以上步骤都要在无菌的条件下进行 ， 防止杂菌的进入 ，造成污染影响试验结果。 定时取 样镜检观察至细胞变成球状原生质体为止，此时原生质体形成。 2.2.4 原生质体 融合 本次实验根霉菌株两株作为亲本制得原生质体，经过灭活再涂布后获得 6 组融合后代菌株，其中 1 号、 4 号、 5 号菌株生长缓慢 6 号菌株基本不生长被舍弃，保留生长较旺盛的 2 号、 3 号和 6 号作为一次融合后代菌种并放于斜面培养基予以保存（根霉菌株由何一鸣同学提供）。 取根霉亲本原生质 10mL 分成两份每份 5mL，放于灭菌小试管中， 2500 r/min 离心10min，弃上清液，用高渗缓冲液离心洗涤二
22、次，除酶。向上述沉淀菌体中加入 1 mL SMM（原 生质体稳定液）溶液，混合后再加入 9mL 40 PEG4000，轻轻摇匀，一份 用 15 W国产紫外线灯管 ， 照射距离 30 cm， 取 5mL 原生质体悬浮液悬浮于无菌平皿中 在 245nm5 的紫外光下 进行 7min 的照射诱变处理 ；一份倒入 无菌离心管中 ， 置于 60 恒温水浴箱中热灭活 60min 取出 。两份同时进行并灭火完毕后取出将两份 原生质体 混合加 PB缓冲液洗涤离心两次，取 0.2mL-0.5mL 涂布到再生平板上 ，在 26 28 条件下 避光培养 23天 。 后用牙签桃取原生质体融合后长出的大菌落点种在基本培
23、养基平板上，生长者为原养型即重组子 。传代稳定后转接于固体完全培养基斜面上，而亲本类型在基本培养基上是不生长的。 2.2.5 传代培养 将活化的菌种接种到马铃薯固体培养基上 ， 浇制 3 个 ， 即第 二 代。 30 恒温培养箱培养 一天 后取一点接种第 3 代 ， 并在另一点盖一盖玻片 ， 再培养一天 ， 用于观察形态特征 ， 最后一点接种到斜面培养基上保存菌种。按这个步骤接种到第 十 代。 2.2.6 菌种 蛋白酶和 淀粉酶活力的测定 用透明圈的比值测定淀粉酶的活力。 2.2.7 SDS 电泳的方法 制胶板的安装（短玻璃面朝内） ， 要求密封 ， 以免胶液泄漏。配制适量（如 7.5mL）的
24、一定浓度的 分离胶 ， 将配制好的分离胶加入制胶槽中 ， 注意应随着边缘缓慢加入 ， 千万别进气泡。凝胶液加至约距前玻璃板顶端 1.5cm或距梳子齿 0.5cm处。轻轻在分离胶溶液上覆盖一层双蒸水封胶 ， 使凝胶表面变得平整 ， 静放 30min-1 小时 ， 使凝胶聚合 14。除去上面的水层 ， 再用滤纸吸尽残留的液体。配制 10的浓缩胶（ 3mL）迅速将配制好的浓缩胶添加到分离胶表面 ， 并将梳子插入凝胶内 ， 至梳子齿的底部与前玻璃板的顶部平齐 ， 小心避免混入气泡。将凝胶垂直放置于室温下 ， 约 30min 凝胶聚合 15。完成后将胶板染色脱色。 2.2.7.1 电泳图扫描方法 将脱色
25、和染色好后的胶板放在玻璃板上进行晾干后 ， 放入 GS-800 Calibrated Densitometer 仪器内 ， 使用仪器扫描得到电泳图。 2.2.7.2 电泳图蛋白质定量分析方法 将扫描后的电泳图使用软件 Quantity one 进行电泳图的分析 ， 在工具栏中 Band 中的 Deterct Bands 对电泳图进行泳道的确立 ， 然后使用工具栏中的 Match 中的 Standards标记标准蛋白 ， 在电泳图上标记蛋白质的位置，最后使用 Analysise 输入标准蛋白质的数值 ， 创建定量标准 对条带进行定量分析 ， 得到定量检验报告。得到样品、亲本和融合后代的蛋白质数值。 2.2.7.3 电泳图蛋白质带分析方法
