1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物 技术 海藻酸钠包埋 TA 降解菌的工艺学研究 摘 要 本研究对对苯二甲酸（ TA）降解菌中降解 TA 的主要活性酶进行胞内胞外的鉴定，并用 3%海藻酸钠，在 0.2M CaCl2 溶液中老化 30min 对其进行包埋试验。实验得出，其降解 TA 的酶主要为胞内酶；在转速为 140r/min，温度为 30 的摇床内，适宜降解的 pH条件为 5-9 之间，包埋菌体量为 30%，在 24h 内能降解的 TA 的最大的量为 0.5123g/L，当 TA 含量高于 0.6623g/L 后开始抑制。 使用 30cm长的层析柱，使上述颗粒装柱，在 TA 浓度为 0.
2、2077g/L，控制温度为 30 ，pH7.0 的流动相中进行工艺学研究。实验得出，填充颗粒 30cm，流速为 30mL/min，降解 TA 的量增加至 0.6138g/L，当 TA 含量高于 0.7846g/L 后开始抑制。 关键词 ： 海藻酸钠；固定；对苯二甲酸；对苯二甲酸降解菌； pH；流速 ABSTRACT This study on terephthalic acid (TA) degradation bacterium in the main active enzyme degradation TA for intracellular exocellular appraisal,s
3、odium alginate by 3%,CaCl2 solution in 0.2 M on the aging 30min embedding test.The obtained its degradation TA enzymes,mainly for the intracellular enzyme;In speed for 140r/min, temperature for 30 ,within the wave bed for the pH conditions for degradation between 5-9,embedding bacteria for 30%,volum
4、e of 24h internal energy in the biggest TA degradation 0.5123g/L,when TA 0.6623g/L higher leels began after inhibition. Use 30cm long chromatography column,the granular packing column for 0.2077g/L TA concentration,temperature control,for 30 ,pH7.0 flow phase. On technology The obtained 30cm,velocit
5、y,filling particles for 30mL/min,to increase the amount of degradation TA 0.6138g/L,when TA 0.7846g/L higher leels began after inhibition. Key words: Sodium alginate; Fixed; Terephthalic acid; Terephthalic acid degradation bacteria; pH; velocity 1 目 录 1前言 . 1 2 材料与方法 . 2 2.1 材料与仪器 . 2 2.1.1 仪器 . 2 2
6、.1.2 药品 . 2 2.1.3 菌种来源 . 4 2.2 实验方法 . 4 2.2.1 对苯二甲酸降解菌的培养与收集 . 4 2.2.2 细胞的固定 . 5 2.2.3 菌体浓度测定 . 5 2.2.4 TA 降解菌酶学性质研究 . 6 2.2.5 海藻酸钠包埋 TA 降解菌的催化研究 . 6 3 结果与分析 . 7 3.1 胞内酶、胞外酶的确定 . 7 3.2 海藻酸钠包埋 TA 降解菌的静态催化研究 . 7 3.2.1 不同 pH 对 TA 降解率的影响 . 7 3.2.2 不 同 包埋量对 TA 降解率的影响 . 8 3.2.3 不同浓度的 TA 的量对 TA 降解率的影响 . 9
7、3.3 海藻酸钠包埋 TA 降解菌的动态催化研究 . 9 3.3.1 不同高度填充颗粒对 TA 降解率的影响 . 9 3.3.2 不同流速对 TA 降解率的影响 . 10 3.3.3 不同浓度的 TA 的量对 TA 降解率的影响 . 10 4 结论 . 11 参考文献 . 12 致 谢 .错误 !未定义书签。 附录 1 文献综述 .错误 !未定义书签。 附录 2 外文翻译 .错误 !未定义书签。 1 1前言 1.1 对苯二甲酸降解菌的研究现状 对苯二甲酸 (Pure Terephthalic Acid，简称 PTA，又称 TA)是一种重要的石油化工产品，是生产聚酯纤维涤纶、塑料增塑剂、农药和染
8、料等化工产品的原料或中间体 1。每1tTA 的生产就会产生 34m3 的废水，其中 TA 的含量高达 1500mg/L。 TA 具有一定毒性 ，对水中微生物的再生有强抑制作用 2。该类废水如直接排入自然环境中，将对水中鱼及微生物的生长、代谢带来严重的危害 3。 众多研究表明 TA 可以被微生物利用分解，并可作为微生物唯一的碳 源被其降解。利用微生物降解对苯二甲酸可以解决由 TA 引起的污染 ， 不会浪费能量，节省资源，不会引起其他形式的污染。 数十年来，科学家一直在研究微生物对对苯二甲酸的降解。小岩成次等 4从土壤之中分离筛选得到七株细菌，能以邻苯二甲酸、间苯二甲酸或对苯二甲酸做为唯一碳源的培
9、养基中进行生长。其中三株为棒杆菌，两株为碱杆菌属，另外两株为节杆菌属。北京大学的林稚兰等 5从合成聚酯纤维涤纶工厂周围被对苯二甲酸粉尘污染的土壤中筛选出了 99 株细菌，其中 17 株经过 24h 的降解，能将初始浓度为 200mg/L 的对苯二甲酸溶液降解 90%以上。南京大学的邹惠仙等 6通过实验证明，从污泥中分离的假单胞菌及土壤天然菌体能降解 TA，并对这株假单胞菌对 TA 的降解动力学研究，证明该菌的作用下，TA 的降解速度符合 Michaelis-Menten 公式，并测定了最适合温度，最佳 pH以及不同温度浓度的降解速度，求出了米氏常数 Km以及各种温度的最大反应速度。 用微生物降
10、解对苯二甲酸一直是科技工作者的热门课题和难题，目前的研究成果很少，且均属于实验室阶段 7-12。大多数是通过分离筛选菌株的方法，证明某些细菌能降解 TA。其中一部分的实验还涉及到细菌粗酶的 提取，并对该菌的酶进行酶促反应动力学进行了研究，张健飞等 13证明菌株提取酶的 km 较小，说明对 TA 的亲和力较强，适于对 TA 的催化降解。官宝红等 14探究了对苯二甲酸降解菌的降解途径，证明 TA 可以分为好氧降解和厌氧降解途径。 1.2 海藻酸凝胶 固定化细胞技术在处理对苯二甲酸中的应用 固定化微生物细胞技术是利用物理或化学的手段将有利微生物细胞定位于限定的空间区域，并使其保持活性反复利用的方法
11、15。固定化微生物技术处理废水与传统的悬浮生物处理法相比，具有处理效率高、稳定性强、能利用不易形成絮凝体的微生物和增殖速度慢的微生物、保持高效菌种、生物浓度高、耐冲击、污泥生成量少、固液分离效2 果好等特点 15。包埋后载体可防止蛋白酶作用和机械损伤细胞，且有较大的容量，包埋法制备的固定化细胞其细胞含量可达 50%70%，全部载体均可利用 16。 1.3 本课题研究内容与意义 本实验通过利用海藻酸钠对 TA 降解菌进行包埋，确定降解对苯二甲酸的最佳 pH、接种量和在动态培养时的最佳填充量和流速，以及在静态和动态实验条件下能降解的TA 的最大的量。随着能源的枯竭和全球环境的恶化，节约能源和环境保
12、护成为本世纪的主题，为此生物技术 成为本世纪热门研究方向。研究海藻酸钠固定 TA 降解菌，不仅实现了利用生物技术降解 TA 废水污染，节约了能源，还利用了固定化材料的稳定性和多次利用性的特性，实现了真正工业上的应用。 2 材料与方法 2.1 材料与仪器 2.1.1 仪器 本研究所采用的主要仪器和设备如表 1 所示。 表 1 主要仪器和设备 名称型号 制造商或产地 电子天平 上海 722 可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 5804R 台式冷冻离心机 Eppendorf 高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂 恒温培养箱 宁波江南仪器厂 WFZ UV-2008H 紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）
13、仪器有限公司 超净工作台 上海 冰箱 青岛海尔股份有限公司 酸度计 上海 HH-2 数显恒温水浴锅 国华电器有限公司 MC99-3 自动液相色谱分析层析仪 上海沪西分析仪器场 DHG9073B5- 恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司 2.1.2 药品 本实验所采用的主要药品如表 2 所示表 2 主要实验药品 药品名称 制造商 42.1.3 菌种来源 由王志江老师提供。 2.2 实验方法 2.2.1 对苯二甲酸降解菌的培养与收集 2.2.1.1 斜面培养基配方 斜面培养基配方如表 3 所示。 表 3 斜面培养基配方 成份 用量 NH4Cl 1.0g/L MgSO4 0.25g/L KH
14、2PO4 3.0g/L Na2HPO4 7g/L NaCl 0.5g/L 对苯二甲酸 1.0g/L 琼脂 15g/L 用 HCl调节 pH7 左右，在 0.1Mpa， 121 的灭菌锅灭菌 20min。 2.2.1.2 液体培养基 液体培养基成分如同斜面培养基，但不添加琼脂。 2.2.1.3 斜面种子活化 取斜面保藏菌株接种于新鲜斜面， 30 下恒温培养。 2.2.1.4 种子培养 对苯二甲酸 上海晶纯试剂有限公司 KH2PO4（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司 NaH2PO4（分析 纯 ) 天津市福晨化学试剂厂 Na2HPO4（分析纯） 天津市福晨化学试剂厂 NaOH（分析纯 ) 浙江
15、中星化工试剂有限公司 HCl（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司 (NH4)2SO4（分析纯） 宜兴市第二化学试剂厂 NH4Cl（分析纯） 宁波市化学试剂厂 NaCl（分析纯） 上海强顺化学试剂有限公司 MgSO4（分析纯） 天津市博迪化工有限公司 Tris 上海源聚生物科技有限公司 5取 1 2 环活化的斜面种子接入装有 100mL 液体培养基的 250mL 三角瓶中， 30 ， 140r/min 的摇床振荡培养 24h。 2.2.1.5 增殖培养 以 1%的接种量将种子液接入装有 100mL 培养基的 250mL 三角瓶中， 30 ，140r/min 的摇床振荡培养 48h。 2.2.1.
16、6 菌体的收集 在离心管中加入 30mL 培养液，在转速为 10000r/min 的条件下离心分离10min，收集细胞。 2.2.1.7 降解率的测定 采用 WFZ UV-2008H 紫外可见分光光度计测定，波长 240nm，以蒸馏水为空 白对照。将测得的数值带入到对苯二甲酸的标准曲线中（ y=0.0784x+0.0077）17，计算出培养基中对苯二甲酸的残留量。 根据公式： %100P T A P T A-P T A 量培养基中原 残量催化后量培养基中原降解率 2.2.2 细胞的固定 将干燥好的海藻酸溶解在蒸馏水中，浓度为 2.5%（ W/V）。 4mL 海藻酸溶液与装有 100mL 培养基
17、的 250mL 三角瓶内培养 48h 的细胞离心，收集的细胞用1mL 0.05M， pH 7.0 Tris-HCl缓冲液混合均匀。将海藻酸和细胞的混合溶液用内径为 0.7mm 的 10mL 一次性医用注射器滴加到 20ml 0.2M CaCl2 溶液中。所形成的凝胶颗粒在室温下凝胶化 30min 后取出洗涤备用 18。 2.2.3 菌体浓度测定 2.2.3.1 菌体生物的量的测定 采用 722 型可见分光光度计测定，波长 600nm。 2.2.3.2 细胞湿重法 细胞培养液经离心处理除去上清后称重，减去该容器的重量即为细胞的湿重重量 16。 2.2.3.3 细胞干重法 细胞培养液经离心后去除上
18、清液并置于 60 的烘箱内烘干至恒重，减去该容器的重量即为细胞的干重重量 16。 62.2.4 TA 降解菌酶学性质研究 2.2.4.1 胞内酶、胞外 酶的 分离 将培养 48h 的培养液在 240nm 下测其吸光度，带入对苯二甲酸标准曲线计算出对苯二甲酸的含量。在离心管中加入 30mL 培养液，在转速为 10000r/min的条件下离心分离 10min，收集上清液，冷冻保存，定为胞外酶。用 0.9%的生理盐水将沉淀细胞洗涤 34 次，去除培养基，将洗净细胞整体作为胞内酶试验。 2.2.4.2 胞内酶、胞外酶的确定 在洗干净的细胞、胞外酶分别放置三角摇瓶中，加入 0.1g/L， pH7.0 的
19、 TA溶液 100mL，并分别测定三角摇瓶中的 TA 的含量。将三角摇瓶放入 30 、140r/min 的摇床中振荡。分别在 1h， 2h， 4h， 24h 测其在 240nm 下的吸光度，由标准曲线计算其降解率，降解率高的为细菌降解对苯二甲酸起主要作用的酶。 2.2.5 海藻酸钠包埋 TA 降解菌的 工艺学 研究 2.2.5.1 静态催化 TA 的研究 （ 1）不同 pH 对 TA 降解率的影响 pH 分别为 5、 6、 7、 8、 9、 10，浓度为 0.1g/L 的 TA 溶液，设平行试验 测定 pH 对微生物降解 对苯二甲酸的速度的影响，同时得到最佳 pH 范围。 （ 2）包埋量 对
20、TA 降解率的影响 包埋量分别为 7.5%、 15%、 30%、 45%、 60%，设置平行试验，以测定包 埋量对微生物降解 TA 的影响。 （ 3）静态培养时不同浓度的 TA 对 TA 降解率的影响 pH 均为 7.0，接种量相同， TA 的浓度分别为 0.0050、 0.0805、 0.1711、 0.3337、0.5123、 0.6623 g/L，设平行试验测定 30 ， 140r/min 摇床中的 TA 的降解率。 2.2.5.2 动态催化 TA 的研究 （ 1）不同填料层高度对 TA 降解率的影响 填充高度分别为 15cm、 22.5cm、 30cm，置于 30cm 长的的层析柱当中
21、，设置平行试验，以测定不同填充高度对 TA 降解率的影响。 （ 2）不同流速对 TA 降解率的 影响 流速分别为 10、 20、 30、 40mL/min，设平行试验，以测定不同流速对 TA降解率的影响。 （ 3）动态催化时不同浓度的 TA 的量对 TA 降解率的影响 7TA 的浓度分别为 0.2013、 0.4345、 0.6138、 0.7846 g/L，设平行试验测定 30 ，pH7.0，最佳流速、柱高条件下的 TA 的降解率。 3 结果与分析 3.1 胞内酶、胞外酶的确定 实验中菌量为 0.0368g，将洗干净的细胞、胞外酶分别放置三角摇瓶中，并分别配置 0.1g/L， pH7.0 的
22、 TA 溶液 100mL，并分别测定三角摇瓶中的 TA 的含量。将 三角摇瓶放入 30 、 140r/min 的摇床中振荡。分别在 1h， 2h， 4h， 24h测定 TA 的量，得其降解曲线如图 1 所示。 图 1 胞内胞外酶的降解曲线0 . 0 0 0 00 . 0 2 0 00 . 0 4 0 00 . 0 6 0 00 . 0 8 0 00 . 1 0 0 00 . 1 2 0 00 1 2 4 24降解时间（h ）残量（）胞内胞外由图可知， TA 降解菌的主要作用酶为胞内酶。因此在下述的实验中，我们可以采取固定细胞的方法来进行实验。 3.2 海藻酸钠包埋 TA 降解菌的静态 工艺学 研究 随着海藻酸溶液浓度的增加，凝胶颗粒会更接近球形，机械强度增大，且生物活性会有所提高，但由于浓度高于 5%（ w/v）的海藻酸溶液难以制备，因此，本实验中采用的海藻酸溶液浓度为 3%（ w/v），并用 0.2%的 CaCl2 溶液与之交联成凝胶。 3.2.1 不同 pH 对 TA 降解率的影响 由于本实验采用的降解底物为 TA， TA 在 pH低于 5 的条件下难溶于缓冲液，因此，实验中配制 pH5、 6、 7、 8、 9、 10 的 0.1g/L 的 TA 溶液作为降解底物。
