1、1 1 本科毕业论文外文翻译 译文： 毕赤酵母的原生质体和分离出的丝状真菌的细胞核融合 来源： Enzyme Microb. Technol., 1997, vol. 21, July *PROMI, Av. Belgrano y Pje. Caseros, Tucumdn, Argentina; Universidad National de San Juan; and *Universidad National de Tucumdn, Tucumdn, Argentina 摘要 ： 原子质体是从丝状真菌串珠镰刀菌的 菌丝及里氏木霉菌中分离出来，并使用聚乙二醇作为融合剂，来融合发酵木糖酵母毕
2、赤酵母的原生质体。混合物是似酵母的形态 ， 当夹紧均匀电场电泳被完成时，能够表现出类似染色体模式向亲代的酵母水解木聚糖。这些杂交被孤立，同时他们的木聚糖酶活性进行定量确定。木聚糖酶活性在亲代的真菌物种在 96 小时时表现出最大的增长；在培养基为 F时，它到达 796nkat 每毫升。在 120 小时时，串珠菌 898nkat 每毫升成长为 T。里氏木霉菌。木聚糖酶活动在其中的一个混合物达到 350nkat 每毫升时，并在 9小时时， 毕赤酵母 本身没有显示出木聚糖酶的 活动。 关键词 ： 华赤酵母 ； 孤立丝状真菌 ； 细胞融合 介绍 半纤维素代表着所有木本植物资料的一个重要的部分，并像是一个
3、大型闲置的蓄水池的碳源为微生物的生长提供环境 ； 然而 ， 大部份的酵母无法正常代谢木聚糖和其他半纤维素的成分。这限制了他们作为碳源 ， 为日益增加的若干环节使用酵母来生产饮料、食品、药品以及许多其他产品。丝状真菌的许多物种产生木聚糖酶和其他的水相酶 ,和一些发酵产生的木糖并产生乙醇。 我们正在调查发酵木糖 ， 通过休哈塔假丝酵母，管囊酵母 ， 和毕赤酵母成为乙醇的研究。酵母菌株的原生质体属于上面所提到的物种与酿酒 酵母的原生质体融合在一起。得到了所有的混合物与木糖相似 ,但没有被同化了。 无论是从其它谷草转氨酶菌株中获得的核酵母株或从不相关的生物中获得的原子核，来使酵母原生质体融合被认为是可
4、行的已有一段时间了。并且它已应用于从大鼠肝细胞核的 DNA 序列中获得的酵母株的构造 (布鲁斯 )。哈茨木霉菌的菌株核已经从相同的菌株或也用另一个相似物种的菌株来融入原生质体 ； 以此浙江万里学院毕业论文 2 产生混合物。 不同种类的曲霉菌及木霉菌的原生质体的融合是公认改良遗传的工业菌株技术的物种。最近 ,据 Kumari 和 Panda7 报道了一种里氏木霉菌和 酿酒酵母 属间的原 生质体融合。 我们最近进行的是一项以从镰胞菌种中的丝状真菌来水解木聚糖，及木霉菌属病菌的酵母种类的毕赤酵母和里氏木酶发酵木糖基因的转移为目标的，并且病菌的物种也同样使用发酵木糖。我们已经成功构建了由原生质体融合似
5、酵母的混合物转为水解木糖。此外 ， 这些似酵母的混合物也保留了发酵木糖成为乙醇能力 ,因此可以用于发酵木聚糖直接制造乙醇。 融合物是需要使用木聚糖作为碳源和以硝酸盐作为氮源以选择性的条件来混合重获的。在融合菌株用于工业用途中，营养缺陷型的标记的使用被认为是不受欢迎的，由于营养缺陷型的转变也可以修改基因控制 的主要工业中的重要特征的酵母。 我们想强调由于亲代的酵母菌种并不采用硝酸盐作为含氮源，也不会使木聚糖变形 ,因此它不会从木聚糖生产乙醇 ， 同时拥有的染色体粒度范围在大多数的酵母中获得。利用硝酸盐的混合物作为一个氮源，发酵木聚糖产生乙醇 ,而且也有同样的大小范围中的染色体作为大多数的酵母。以
6、取得真正的混合物。这篇论文研究结果是混合物的具有特点。 材料与方法 有机体 酵母有毕赤酵母。真菌有串株镰刀菌，赤霉病菌 ， 镰刀菌 ， 和尖孢镰刀菌是在宾夕法尼亚大学的研究中心，由阿根廷的安蒂奥基亚大学的 S.Chulze 博士进行研究的， 此外里氏木酶是由阿根廷西北部沼泽地的安蒂奥基亚大学的 Cuevas博士进行研究的。 栽培维护 丝状真菌维持在 PDA偏含 10克 L葡萄糖。毕赤酵母仍保持在 YEPD琼脂含 10gL酵母提取物、 20gL蛋白胨 ， 其次是 20 克 L葡萄糖 ， 15gL夏甲。此外有机体以 15天为一定期做培养。 丝状真菌的培养媒体 浙江万里学院毕业论文 3 丝状真菌的栽
7、培介质主要是将碳源添加到 20克 L葡萄糖或 birchwood20克L木聚糖的媒体中。 融合产物再生的重建媒介 在融合产物中发现了 10gL木聚糖 ， 2gL酵母提取物、 0.6MKC1(作为一种渗透稳定剂 )， 和 30gL夏甲的查氏介质。 融合产物的选择性介质 为了研究在不同的媒体中毕赤酵母与融合产物的成长能力 ， 这些细胞被培养下列媒体 ： a) C-Glu：包含 20g/mL葡萄糖的查氏介质。 b) C-Xln：包含 20g/mL木聚糖的查氏介质。 c) C-Xln-YE：包含 20g/mL 酵母膏和 20g/mL木聚糖的查氏介质。 d) YNB-Xln： 6.7g/mL酵母氮基（培
8、养基）混合 20g/mL木聚糖。 e) YNB-Xln-YE： 6.7g /mL酵母氮基（培养基）混合 20g/mL木聚糖和 20g/mL酵母膏。 f) YNB-Glu： 6.7g/mL酵母氮基（培养基）混合 20g/mL葡萄糖。 YNB-/酵母氮基（培养基）混合 20g/mL木胶糖。 在所有的介质中，琼脂浓度是 20g/mL。 木聚糖酶活性测定的媒介 木聚糖酶活性是在 XP-Xln 介质中测定其栽培生长率 (10gL酵母提取物、20gL蛋白胨和 20gL木聚糖 )。 发酵媒体 亲代菌株毕赤酵母，串株镰刀菌，里氏木酶与融合的产品 ,来测试发酵木糖和木聚糖产生乙醇的能力。 发酵媒体的合成物是 ：
9、 a) YP-Xyl： 10gL酵母提取物， 20gL蛋白胨 ， 和 20gL木胶糖。 b) YP-Xln： 10L酵母提取物， 20gL蛋白胨 ， 和 20gL木聚糖。 丝状真菌培养 为了进一步的融合来选择真菌菌株 ， 串株镰刀菌 NRRL13616，赤霉病菌NRRL5883， 镰刀菌 NRRL6322，尖孢镰刀菌，和氏木霉 QM9441的栽培都生长浙江万里学院毕业论文 4 在含有 50毫升的锥型的介质与 20gL木聚糖的蔡氏培养基的 250毫升烧瓶里。接种的烧瓶是一种接种物 ， 相当于 7 克干菌丝体体重 L介质在 30C 及在 200个每分钟转速的一个震动器中孵化，并定期抽样。木聚糖酶活
10、性在每一个样品中进行测定。 真菌菌丝形成的原生质体 氏木 霉和串株镰刀菌的文化是以被里长为 250-ml锥形瓶烧瓶包含 50毫升的察氏培养基同 50克 1葡萄糖作为碳源。这些文化中被灌输 1射线异物检查装置真菌孢子每毫升， 18小时，在 30 并在一个以 200转速旋转摇荡器孵化。菌丝体被恢复成为附近的的过滤和濯三次同无菌水。被洗净的菌丝体只能以包含 0.01米二硫苏糖醇在柠檬酸盐磷酸盐缓冲血液酸碱度 7.3，和孵化为 1 综合质量控制在 30 源文件的预处理方法。并且 mycelium当时过滤桶的滤波器纸，被同一个柠檬酸盐磷酸盐洗三次 ， 由 0.7mKCl代替 5.8作为一个渗透的稳定剂。
11、生 物的数量以 PH值 5.8，并包含 0.7KC1和 7mgmL Novozym234的血小板分离术的缓冲器。 KCl 被添加为一个渗透的稳定剂。在 30 的悬浮物搅动在 100 每分钟转数为 4-5小时间的最佳组合被孵化，并被监测下一个相衬显微镜。并且该通过过滤，其他的碎片，将同一个渗透洗三次，消除为菌体丝。 核分离的真菌 氏木霉的细胞核和串株镰刀菌 ， 在 4C 时，采用细胞溶解原生质体的差速离心在聚蔗糖溶液剂的作用下被分离如下： i)原生质体培养溶液中包含了 180克 L聚蔗糖 ， 20毫米 KH2PO4， 钙离子 ，和 pH值为 6.5苯甲基磺酰化氟 (PMSF)。该方案溶解了原生质
12、体 ， 而不能使核保持完整。 ii)细胞核悬浮液是处理内含有 70 克 L聚蔗糖 ， 20 毫米 KH2PO4， 0.5 毫米钙离子， 1毫米 PMSF， 1米山梨醇、和 200克 L甘油在核心净化的溶液。 最终的净化颗粒重新分散在 0.5 毫升的溶液 .所提到的步骤二和使用酵母原生质体使核立即融合。在荧光显微镜下，观察到孤立的细胞核被 DAPI沾满。 酵母的原生质体与丝状真菌的核的融合 酵母原生质体通过标准的方法获得。原生质体被重新分散在 0.4 米 CaCl2的0.5 毫升溶液，并与细胞核悬浮液混 合 ， 在 10 分钟內分离在 12000g。上清液被浙江万里学院毕业论文 5 抛弃，同时颗
13、粒重新分散到融合的混合物中。悬浮液在 25C 待 10分钟并被孵化。 融合产物的再生 熔液添加到稳定渗透，在 42C 下，融化再生介质，混合、倒作为一种叠加在相同的再生的介质中 ， 并使其变硬。在 30C 下孵化 4-5 天 ， 直到似酵母的细菌出现。这些细菌被转移到选择性媒体 C-Xln-YE中来分离理想的融合产物的特性。似酵母的细菌在 C-Xln-YE介质上生长，并面临选择。 木聚糖酶活性的测定 似酵母的混合物和丝状真菌的亲代菌株在 YP-Xln介质被培养。定期测定木聚糖酶 活性 ； 这是在上清液确定为似酵母的混合物和通过二硝基水杨酸方法对丝状真菌过滤。木聚糖酶活性 ， 表现在 nkat每
14、毫升 。 发酵试验 发酵试验 ， 毕赤酵母和似酵母混合物分别在 YP-Xyl 和 YP-Xln 媒体，并以24 小时的周期， 120-144 小时间在 30C 的丝状真菌与最少的搅拌 ， 在介质里允许少量的氧气进行的。定期采样培养。乙醇和木糖的浓度由高效液相色谱法和高效液相色谱法测定木聚糖的苯酚 /硫酸的方法所决定。 脉冲场凝胶电泳 电泳的分析执行是通过使用基于 CHEF 技术的 CHEFDRII 系统。琼脂插头依据前述方法准备。凝胶是在 0.5X电脉缓冲液下，使用 1%染色体品位的琼脂。脉冲周期在 12 小时到 60 小时间，在 125-450 脉冲中转换 ， 并分别在 0.5X 电脉缓冲液
15、下在 14C 的缓冲区被用来分离染色体。 研究结果 为了在融合时，选择作为亲代的真菌菌株。不同真菌菌株 (见材料和方法 )的分批培养物都生长在 C-Xln介质中，并在 30C 温度下，在旋转摇荡器以 200每分钟转速进行操作。在七天中，样品每隔 12 小时被拿出来。并对木聚糖酶活性进行了测定。 氏木霉和串株镰刀菌表现出最高的木聚糖酶活性 (表 1),并用他们的核和毕赤酵母的原生质体的得以融合。 在分析这些检测中的酵母原生质体的构造是在显微镜下进行比较，监测的。原生质体维持在一个稳定渗透的溶液里 ,随后被当作是一种亲代菌株与两种真菌浙江万里学院毕业论文 6 核的融合。 用过滤设备，将真菌原生质体
16、从菌丝片段中分离出来。孤立原子核被 DAPI沾满，并在显微镜下观察他们的纯度和完整性。孤立的细胞核在形态学上是完整的，并且不受细胞污染的影响。在显微镜下观察真菌核，并不能看到原生质体。当第二次控制和检验中 ,既没有真菌细胞也没有孢子在细胞核悬浮液中 ， 一小份的悬浮液涂沫在皮氏培养皿中并含有再生介质，来用于融合产物再生。 7天之后，在 30C 下， 没有观察到生长和孵化。 毕赤酵母的原生质体与串珠镰刀菌、氏木霉的核融合在一起。从这两项实验的融合产物可以在分化培养基中找到了。在 30C 下，孵化 4天 ， 细胞分离，并转移到选择性媒体 (C-Xln-YE)来决定是否这个混合物显示任何的丝状真菌的
17、生化特性。细胞表现出似酵母的形式，但没有产生菌丝。 融合产物被首次转移到 C-Xln-YE介质中，用于他们的重获。这种媒介有木聚糖作为唯一的碳源和 NaNO3， 和唯一的氮源。这种媒介支撑所有的融合产物孤立的增长。木聚糖作为碳源和硝酸盐作为氮源的不由毕赤酵母同化吸收 ， 但由丝状菌用 于融合、吸收 ； 因此 ， 混合物必须取得能力从真菌源中吸收木聚糖和硝酸盐氮。 作为控制 ， 毕赤酵母的原生质体电镀在包含了 0.6MKC1 作为一种渗透稳定剂的 YP-Glu上。经过几天的孵化 ， 众多细胞发展起来。这个结果表明 ， 在原生质体技术之后，细胞是可以养活的。 作为第二控制 ， 毕赤酵母的原生质体与
18、串珠镰刀菌、氏木霉的核分别在融合的混合物重新分散。在 25C 下，孵化 10分钟，并融化分化培养基，倒在皮氏培养皿上 ， 但是没有细胞出现。融合实验结果表明 ， 在本实验中 ， 融合核或是融合毕赤酵母在分化培养基中是不可行 ,只有真菌酵母核的原生 质体溶液可以生长在C-Xln-YE媒体中。 为了确保细胞的纯净 ,融合产物转移到含有 C-Xln-YE 媒介上。并在 30C 下孵化，直到细胞变得明显。本程序应该重复 5 次 ,以确保似酵母的混合物在以木聚糖作为唯一碳源介质中的稳定性。随后 ， 细胞将脱离，并储存同样的媒介中。 从氏木霉和毕赤酵母得到熔体已经由 “FVPT”表示。那些从串珠镰刀菌和中
19、毕赤酵母获得的熔体，由 “FVPM”并跟随一个序列号来表示。 浙江万里学院毕业论文 7 融合产物转移到 C-Glu介质。这个介质中不存在分化培养基的酵母精华。而硝酸盐氮是唯一氮源。虽然毕赤酵母中不存在，但所有的 混合物都生长在这个媒介中。由于这个物种不吸收为氮源的硝酸盐氮 ， 因此 ， 这个混合物从丝状真菌中也获得了这一特性。 似酵母的混合物转移到最低限度，并包含不同碳源的介质中。当似酵母的混合物被转移到 YNBXln 介质中时 ,虽然所有都会在 YNB-Glu和 YNB-Xyl媒体中生长，但在这里只有四个生长。融合产品转移到含有 YNB-Xln-YE 媒体中的平板上，能得到积极的生长。因此
20、,十二个似酵母的混合菌株不能生长在 YNB-Xln介质中，而酵母要求生长在一个最小的以木聚糖作为唯一碳源的介质中。 用 CHEF来分离混合物的染色体表明 ， 融合的产品能够改变了基因组。我们在分离条件下 ， 从毕赤酵母中得到凝胶显示出 3 种染色体波段。然而 ,这个物种能被观察到六中频率。从混合物 FVPM903的准备中，能清晰地显示出一个更多的频段。这种模式确认 FVPM903是一种得到亲代基因重组毒株的混合物。 没有混合物可以显示出在基因组中能包含完整的真菌染色体。这些大大超出酵母的染色体；因此 ， 似酵母的混合物基因本质上由酵母的基因组加上一些从真菌基因组的基因组成。这是根据我们以前在酵
21、母属糖化酵母的原生质体和还有一些其它的酵母种类之间发现的，混合物的基因组本质上形成了糖 化酵母基因组加上一些从次要的亲代组中的基因。 Groves和 Olivier也从中获得了类似的结果。 毕赤酵母，串珠镰刀菌，氏木霉和所有的融合产物都在 YP-Xln木聚糖酶的活动进行了测试。试验 ， 并定期抽取来确定在样品的细胞中的木聚糖酶。最高的木聚糖酶活性用 nkat每毫升报道。 为了确定杂交菌株是否能使木糖发酵或木聚糖产生乙醇 ,发酵试验将选定的四项的混合物进行 ， 这也显示出最高的木聚糖酶的活动。 作为一种控制，发酵试验与所有的亲代组一起执行。在方法和材料中描述了这种发酵介质。 发酵试验在 30C
22、下，并在伴有轻度震荡 的分批培养物中 ， 以确保溶解氧的存在在培养物中。培养物将被定期采集。乙醇产量和碳源的消耗 ,由各样品所确定。由于亲代菌株不代谢木聚糖，因此在毕赤酵母介质里不能检测出含木聚糖。 木糖和葡萄糖都不能单独通过 HPLC 测定，在无菌媒体中，来分析与作为唯浙江万里学院毕业论文 8 一碳源的木聚糖；因此 ， 细胞生长使用木聚糖作为碳源。 在这些条件下 ， 可以得到乙醇的浓度峰值，乙醇产量用 g表示，而碳源的消耗在表 3中含木糖介质、表 4中含木聚糖的介质有显示出来。木糖完全被混合物消耗掉至少要 24 小时 ， 但当木聚糖是唯一碳源时，只有三分之一的聚合物会在 24小时后 被消耗。
23、 讨论 我们已经通过酵母原生质体和丝状真菌的细胞核的融合，从毕赤酵母 ， 发酵木糖物种和串株镰刀菌，也在毕赤酵母 ， 氏木霉中成功地取得似酵母的混合物。融合物作为一种选择标记或硝酸盐氮的其他标记，被用作使用木聚糖能力。木聚糖水解是一种非常稳定的特性 ,而酵母回复体降解木聚糖的能力从来没有被发现过。合理利用硝酸盐氮能够较广泛地传播酵母 ， 但在大自然中的酵母，正如存在木聚糖，却不能回复到有能力去利用硝酸盐氮。利用各种碳水化合物和相关的碳化合物的能力是一种较不稳定的特征 ,但是这种能力而被成功应用的选择性标记作为融合酵 母的隔离产品。 在操作中获得的似酵母的混合物，能够水解聚合木聚糖和代谢木糖，以
24、使其释放出来。所有发酵试验以纯粹的文化进行。在显微镜下的定期监测的培养中，没有出现真菌污染。 似酵母的混合物也能够利用硝酸盐氮来作为唯一氮源。而毕赤酵母既不能利用硝酸盐氮也不能水解木聚糖。作为亲代的关系 ,毕赤酵母和似酵母的混合物，从形态学方法和生物化学的观点来看是相似的。通过 CHEF来分离染色体，并比较亲代酵母和融合的产品。大多数真菌物种的染色体都很大 ， 且相同条件下的酵母不能被看到 ， 这就是他们不包括在内的原因。 酵母原生质体与真菌 核的融合，对转移基因不同的有机体的基因不同种类的酵母是一种很有前途的技术。通过如上所述方法，我们获得的混合物 ， 将被进一步进行调查。 浙江万里学院毕业论文 9 浙江万里学院毕业论文 10
