1、本科毕业论文 文献综述 食品科学 细胞固定化与无载体固定化的研究 摘要 ：固定化的概念最早是在酶工程领域被提出来的，其原理是用各种方法将水溶性的酶与惰性的载体相结合形成固相酶，这样就可以使价格昂贵的水溶性酶被多次使用。但是酶是蛋白质，它的催化活性与它的空间结构紧密相关，在很多的情况下固相酶的催化活性都不高，但是由于大多数的酶都来自胞内，而胞内的环境可以使酶保持良好的空间结构，这样就能极大提高固相酶的催化活性，因此人们提出了固定化细胞的概念。本文主要介绍了有载体与无载体两种细胞固定化的方法、优劣，以及以后的应用前 景。 关键词：固定化 ； 载体 ； 方法 ； 展望 1 固定化细胞技术简介 早在
2、19 世纪初人们就发现，某些微生物的细胞具有一种能吸附在固体物质表面的天然倾向和一些特殊功能，并且以这种方式被固定起来。当时人们曾以这种方法来利用被吸附的微生物细胞来生产乳酸 1-2。而后又有人用类似的方法来处理污水 3。 从 60 年代开始，国际上关于固定化酶的研究开始迅猛发展，到了 70 年代，关于酶源的微生物细菌体本身的固定化，即微生物固定化，也引起了人们相当大的关注。 所谓固定化技术，就是指利用化学或物理手段将游离 的细胞（微生物）或酶，定位于限定的空间区域内并使其保持活性而且可以反复使用的一种基本技术 4。其包括了固定化酶技术和固定化细胞技术。 2 无载体固定化细胞技术简介 人们已经
3、发现，某些微生物细胞具有自絮凝 (Self flocculating） 形成颗粒的能力 5，利用这种细胞自絮凝形成的颗粒的能力作为一种固定化细胞的方法，是固定化细胞技术中的一个全新概念，与各种有载体固定化细胞技术相比，这种无载体的固定化细胞技术有非常突出的优点，主要体现在：细胞固定化的方法非常简便，一般在摇瓶培养阶段就可以使其快速 形成絮凝颗粒，然后絮凝细胞颗粒可以在生物反应器中开始逐级扩大培养，不增加细胞固定化过程中的其它附加成本。不使除用细胞生长和代谢产物生物合成所需要的营养物质以外的其它任何化学物质，细胞的生理和生态环境受到外来物质干扰和影响的几率为零，有利于目标代谢产物的顺利合成。自絮
4、凝细胞颗粒内部结构形状松散，传质阻力非常小，而且颗粒内部表面会不断的自我更新，使颗粒整体的活性非常好。在生物反应器中一定的条件下，小颗粒的絮凝和大颗粒的解离可以呈现动态平衡，不存在载体固定化细胞中的强度问题。 3 细胞固定化的方法 关于固 定化细胞的制备方法有很多种，任何一种限制细胞自由流动的技术都可用来制备固定化细胞，因此很难做出精确的分类。不过一般来说可以分为四大类：吸附法，交联法，共价结合法，和包埋法。 3.1 吸附法 吸附法是依靠带电微生物的细胞和载体之间的静电力、表面张力和附着力的作用，使微生物细胞固定在载体表面和内部形成生物膜的方法 6。这是一种价格非常低并且有效而常用的微生物固定
5、化细胞的方法。吸附法可以分为物理吸附和离子吸附两部分。物理吸附是指用具有高吸附能力的物质，如硅胶、活性炭、多孔玻璃、碎石、硅藻土、卵石、焦炭、多 孔砖等作为吸附剂，将微生物吸附在其表面使其固定化的方法。离子吸附是指利用微生物在解离状态下的离子健作用而固定在带有相反电荷的离子交换剂上，最常见的离子交换剂有 DEAE-纤维素、EM-纤维素等。吸附法操作简便，微生物固定过程对细胞的活性影响较小，但是固定的微生物数量受到所用载体的种类以及载体表面积的限制 7。 3.2 交联法 交联法，又被称为无载体固定法，是通过微生物与具有两个或者两个以上官能团的试剂进行反应，使微生物菌体相互连接成为网状结构使其达到
6、固定化微生物的目的 8，最常见的交联剂是戊二醛。交 联法中微生物的结合强度高，稳定性好，对环境变化的耐受能力强，但是微生物的活性有比较大的损失，同时交联剂也比较昂贵，这些都限制了该方法的应用。 3.3 共价结合法 共价结合法是细胞表面上功能团 (如巯基、羟基、氨基、羧基、和咪唑基等 )和固相支持物的表面反应基团之间形成化学共价键而进行连接，从而成为固定化细胞的方法。该固定化方法的微生物稳定性好，不易掉落。但是限制了微生物的活性，反应条件十分激烈，操作与控制比较复杂。有研究者使用此方法固定卡尔酵母 (Saccharo.myces luteus)于已活化的多孔玻 璃上 9，虽然细胞已经死亡，但是仍
7、然留下了生产尿酐酸的活性。 3.4 包埋法 包埋法是使微生物细胞包埋在半透明的聚合物或膜内，或者使微生物细胞扩散而进入具有多孔性的载体内部，使小分子底物以及反应代谢产物可以自由出入这些多孔膜或凝胶膜，而微生物却不能动的方法 10。包埋法是一种最常用的微生物固定化方法。这种固定化方法操作十分简单，对微生物细胞的活性影响很小，制作的固定化凝胶珠的强度高，但是包埋法制备工艺比较复杂，而且制备成本高，并且载体无法再生，传质阻力大，这些严重影响了微生物的生长和产物的代谢。 4 固定化细胞的优势与劣势 固定化细胞过程具有以下几个方面的优点： 第一， 生物反应器中可以获得极高的菌体浓度，并且连续发酵的稀释速
8、度可以大大提高，反应器的生产设备强度得以强化。 第二 产物分离纯化的过程中菌体从发酵液中的分离非常容易。 第三 固定化细胞可以重复或者长期使用，这样既能够简化在游离细胞阶段需要不断培养菌体的操作，又减少了营养基质的浪费；传统的固定化细胞技术均可使用各种载体材料，以包埋、吸附、交联等方式实现细胞固定化，但是载体材料的使用随之带来了许多细胞生理、生态、工程、工艺和经济方面等诸多问题，主 要体现在生理方面 ， 载体材料有时会对细胞产生非常大的生理毒性，对于那些相对脆弱的动物细胞来说，甚至会导致细胞的死亡，因此会影响目标代谢产物的生物合成。 在生态方面 ， 载体材料使细胞或者小细胞群相互分离，容易出现
9、不利于细胞间彼此协调的环境，而影响代谢产物的生物合成，这对于动物细胞或者植物细胞的培养过程来说显得尤为突出。工艺方面：有载体固定化细胞的大规模制备过程比较复杂，容易引起杂菌感染。 在 工程方面 ， 一方面是载体固定化细胞的传质性能差，外部营养基质和内部代谢产物的浓度梯度大，导致其整体活性变低；另一方面生物反应器中流 体的流动冲刷和代谢过程内部产生的气体胀裂还会造成固定化细胞的破裂，影响其连续使用的次数 。在 经济方面：载体材料的使用和不断的消耗带来了其它附加成本，使固定化细胞技术难以在传统发酵工业中进行推广和应用。因此，载体固定化细胞技术虽然已有将近四十年的研究历史，但真正实现大规模工业化应用
10、成功的实例却不多。 5 固定化的应用与展望 5.1 固定化细胞技术的应用与展望 固定化细胞技术自从问世以来，其应用领域已经涉及到食品、化学、医药、环境保护和能源开发等诸多领域，显示出其广阔的发展前景。主要包括 :用于生产各种胞外产 物，如酒精酒类、氨基酸、有机酸、酶和辅酶，还可以用于甾体转化、废水处理等等。目前，固定化细胞技术还不够成熟，在固定化细胞的载体是否有毒性以及其性能是否良好，固定化细胞的机械强度、传质性能和有无杂菌干扰等方面还存在一些不足，所有这些因素通通限制了固定化细胞技术的发展和应用。但是随着生物技术及材料科学、化工等各类相关学科的发展，相信固定化细胞的技术会有全新的进展，它的应
11、用前景也将更加美好。 5.2 无载体固定化细胞技术的应用与展望 传统的载体固定化细胞技术对于生物反应器和原料的处理工艺没有特殊的要求，一般 来说只是需要将固定化细胞颗粒装填到生物反应器中即可。但是无载体固定化细胞技术中的自絮凝细胞颗粒却对生物反应器的设计和生产原料的处理有着一些特殊的要求，主要体现在以下二个方面。一是自絮凝细胞颗粒的形态不是规则的，大小呈一定的分布，刚性比较差，十分容易变形，不可多次剪切，只有在生物反应器中实现均匀悬浮才能够有效的进行代谢产物的生物合成。因此开发出适宜的生物反应器并且解决工程放大问题才能有效的进行工业推广。二是许多传统的微生物发酵工艺都是采取粗原料，甚至是原料带
12、渣发酵，自絮凝细胞颗粒的生物反应体系不允许有原料的残 渣存在，即要求清液发酵，这就造成了这一新工艺技术在传统产业中的应用和推广方面有比较大的困难但是这种无载体固定化细胞技术所体现出来的细胞固定化过程附加成本、生物反应过程的极高效率 (与游离细胞过程相比其生物反应的速率可以提高十几倍甚至几十倍 )、反应后体系中细胞分离难度的降低、细胞可以长期连续多次使用等等优点，都展示了该工艺技术在传统发酵工业如酒精发酵、味精发酵、氨基酸发酵等领域具有广阔的应用前景，同时在现代生化工程技术领域中如动植物细胞培养、生产次级代谢产物的过程等也有着十分巨大潜在的价值。 参考文献 1 王洪祚 ,刘世勇 .酶和细胞固定化
13、 J.化学通报 ,1997,2:22-27. 2 Atkinson,B.and Mavittuna,F.Immobitized Cell SystemsM.Biochem.Eng. Biotech Handbook,2th.1991,5:768-769. 3 段明峰 ,吴卫霞 ,肖俊霞 ,等 .利用固定化细胞技术处理废水研究进展 J.环 境 保护 ,2004,9(3):17-20. 4 郭雪琳 .王成瑞 .固定化微生物技术在废水处理中的应用 J.广东化工 ,2007,34(8):67-69. 5 刘钧 ,周力 .固定化微生物技术在废水处理中的应用分析 J.净水技术 ,1998,1:35-39.
14、 6 Scott C D.Immobilized cells a review of recent literatureJ.Enzyme and Microbial Technology.1987,9(2):66-73. 7 刘蕾 ,李杰 ,王亚娥 .生物固定化技术中的包埋材料 J.净水技术 ,2005,24(1):40-42. 8 Isono Yasuyuki,Araya Gen-ichiro,Hoshion Akira.Immobilization of Saccharonmyces Cerevisiae for ethanol fermentation on g-alumuia part
15、icles using spray-dryerJ.Process Biochem.1995,30(8):743-746. 9 吕晓猛 .固定化细胞珠体的改性研究 J.北京工业大学学报 ,1997,23(1):87. 10 李淑彬 , 钟英长 . 固定化假单胞菌降解甲胺磷的研究 J. 应 用与环境生物学报 ,1999,5(4):422-426. 11 赵军 ,曹亚莉 ,骆海鹏 ,等 .固定化甲烷八叠球菌处理高浓度有机废水的研究 J.可再生能源 ,2002,104(4):10-13 12 Lee S T,Biodegration of pyridine by freely and suspende
16、d immobilized Pimelobacter sp.J.Appl Microbiol Biotechnol,1994,41:652-657. 13 吴乾菁 .固定化酵母菌细胞去除 cd.的研 究 J.重庆环境科学 ,1996,18(3):16-19. 14 Baillez C.hnmobilization of botryococcus braunnii in alginate influence on chlorophyll content photasynthetic activity and degenration during batch cultureJ.Appl Micro
17、bil Biotechnol,1986,23:361-366. 15 Conner M A and Allgeier R J.Adv Appl Microbial,1976,28:878-885. 16 Chibata Z and Tosa T.Appl Biochen.Bioeng,1983,4:1-9. 17 Scott C D Enzyme Mircrob Techonl,1987,9:66-73. 18 杨基础 .双歧杆菌固定化的研究 J.微生物学通报 ,1996,23(1):35-36. 19 Jo-Shu Chang.Decolorization of azo dyes with immobilized Pseudomonas luteolaJ.Process Biochemistry,2001,36:757-763. 20 Hattori,T and Furusaka JJ Biochem,Tokyo.1959,48:831-832. 21 张蕾 ,段连生 .微生物固定化技术在废水处理中应用的研究进展 J.湖北第二师范学院学报 ,2009,26(2):36-39. 22 王建龙 .生物固定化技术与水污染控制 M.北京 :科学 出版社 ,2002:25-31.
