1、 本科毕业论文（设计） 论文题目： 酸乳中嗜热链球菌的分离及其海藻酸钠包埋活性分析 所在学院 生物与环境学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 指导教师 职称 完成日期 年 月 日 摘 要 本研究 是 从市售酸乳中分离出嗜热链球菌，以藻酸钠为包埋剂，对 嗜 热链球菌 进行包埋。采用稀释平板计数来测定乳酸中嗜热链球菌的活菌数，考察了海藻酸钠，氯化钙的浓度及凝胶珠的大小、保存时间对嗜热链球菌包埋率的影响。结果显示适宜的包埋工艺条件为海藻酸钠浓度 4%，氯化钙浓度 1.0%，凝胶珠的大小采用 5mL 医用注射器成型，在此条件下包埋率最高可达 95.69%，保存时间可达 1 个
2、月。嗜热链球菌经过海藻酸钠包埋后，具有比较稳定的生物活性和耐久保存特性，为益生菌制剂的生产和应用方面提供了参考。 关键词 :嗜热链球菌；包埋；海藻酸钠ABSTRACT This study was from the city of the sale of milk in the isolated from Streptococcus thermophilus,with sodium alginate as entrapment agent,on Streptococcus thermophilus by embedded.By the dilution plate count to deter
3、mination of lactic acid in Streptococcus thermophilus viable count,investigated the concentration of calcium chloride and sodium alginate,gel bead size,save time on Streptococcus thermophilus embedding rate effect.Results show that proper embedding conditions for the concentration of sodium alginate
4、4%,the concentration of calcium chloride1%,gel bead size using 5mL medical syringe molding,under this condition the embedding rate up to 95.69%,the preservation time of up to 1months.Streptococcus thermophilus through sodium alginate embedding,has stable biological activity and durability properties
5、,production and application of probiotics preparation for provides the reference. Key words: Streptococcus thermopHilus; Embedding; Sodium alginateI 目 录 1 前言 .1 2 材料和方法 .3 2.1 材料与仪器设备 .3 2.1.1 试剂 .3 2.1.2 仪器 .3 2.2 实验方法 .4 2.2.1 培养基及溶液的配制 .4 2.2.2 嗜热链球菌的分离 .5 2.2.3 革兰氏染色 .5 2.2.4 菌种保藏 .5 2.2.5 嗜热链球菌
6、包埋 .5 2.2.6 平板稀释计数 .6 2.2.7 包埋凝胶珠的溶解 .6 2.2.8 包埋率计算 .6 2.2.9 包埋条件的研究 .6 3 结果与分析 .7 3.1 嗜热链球菌分离结果 .7 3.2 包埋条件对包埋率影响的研究 .7 3.2.1 海藻酸钠浓度对包埋率的影响 .7 3.2.2 氯化钙浓度对包埋率的影响 .8 3.2.3 凝胶珠大小对包埋率的影响 .9 3.2.4 保存时间对包埋率的影响 .10 4 结论 .11 参考文献 .12 致 谢 .13 1 1 前言 1.1 乳酸菌概况 乳酸菌是指能发酵的碳水化合物 (如葡萄糖 )产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。凡是能从葡萄糖
7、或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，至少目前可分为 18 个属，共有 200 多种。除了极少数以外，其中绝大部分都 是人体内必不可少的并且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。 在丰富的细菌资源中，有些细菌具有改善宿主微生态平衡而发挥有益作用，使宿主能够提高健康水平和健康状态，被称为益生菌。乳酸菌是益生菌中最重要的一群，乳酸菌是一种存在于人类体内的 益生菌 ，乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名。据研究益生菌活菌制剂及其代谢产物具有诸多保健功能，因此常被视为健康食品，添加在 食品之中。 较常用的乳酸菌益生菌有双歧杆菌、乳杆菌和嗜热链球菌等
8、1。 乳酸菌发酵能产生大量的有机酸、醇类及各种氨基酸等代谢物，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌等生理功效 2。乳酸菌除了增加体内的有益细菌、增强免疫力之外，还有下列功能： 有色人种防治普遍患有的乳糖不耐症（喝鲜奶时出现的腹胀、腹泻等症状） ； 促进蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收，产生维生素 B 族等大量有益物质 ； 使肠道菌群的构成发生有益变化，改善人体胃肠道 功能，恢复人体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护人体健康 ； 抑制腐败菌的繁殖，消解腐败菌产生的毒素，清除肠道垃圾 3； 抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压 ； 免疫调节作用，增强人体免疫力和抵抗力 ； 抗肿瘤、预防癌症 ； 提高
9、 SOD 酶活力，消除人体自由基，具抗衰老、延年益寿的作用 ； 有效预防女性泌尿生殖系统细菌感染。控制人体内毒素水平，保护肝脏并增强肝脏的解毒、排毒功能等 4。 乳酸菌制剂或发酵乳被证明具有抑制动物体内移植癌或化学自发癌癌细胞的增值，也有抑制长期人工饲养动物的自然发癌效果。所做调查研究也显示摄入发酵乳可抑制乳癌发生，以及膀胱癌的再发生 5。世界发达国家首先认识并开创了以使用乳酸菌为代表的免疫疗法革命。瑞典科学家研究发布的结果是，治疗胃和大肠炎症时直接喝乳酸菌比使用抗生素效果更好，危险性几乎为零。其作用机2 理也由动物及人体实验逐渐证明是因为免疫调节作用以及抑制肠内菌丛产生致癌关联物质 6。 1
10、.2 嗜热链球菌概况 嗜热链球菌来源于乳制品。它是一种耗氧的格兰氏阳性菌，以两个卵圆型为一对的球菌组成约 0.7 到 0.9 纳米的长链。在 选择性培养基 中，嗜热链球菌会长成米色的菌落。嗜热链球菌作为乳酸菌中的一种益生菌除了具有益生菌的生理特性外还有其自身的生理特性： 对胃酸有良好的耐受性，嗜热链球菌在 pH6.8 的酸性溶液中的存活率是 100%，在 pH4 的酸性溶液中的存活率约是 75%，在 pH3的酸性溶液中的存活率约是 70%； 对胆盐的耐受性好，胆盐对嗜热链球的生长有一定的抑制作用（抑制率约为 28%）。然而嗜热链球菌依旧能够在较高浓度的胆汁中生存，所以可以在人体内免受胆汁的损害
11、而到达小肠的远端 ； 对肠道致病菌的抑制，嗜 热链球菌能使艰难梭菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌的菌落直径减少约 30%；能使 金黄色葡萄球菌 、单核细胞增生李斯特菌、 产气荚膜梭菌 的菌落直径减少约 20%。 1.3 乳酸菌固定化 细胞固定化是指用物理或化学方法使酶成为不溶性衍生物或使细胞成为不易从载体上流失的形式制成生物反应器用以催化 生化反应 、细胞数量的增殖的方法。它包括 固定化酶 技术和 固定化细胞技术 两种。固定化细胞载体主要可分为两大类，一类是无机载体，如硅藻土、活性炭等；另一类是有机载体，又可分为两种，一种为天然高分子凝胶载体，如琼脂、 角叉莱胶和海藻酸钙等，它们无生物毒性，传质性
12、好，但强度低，在厌氧条件下易被生物分解。另一种是有机合成高分子凝胶载体，如聚丙烯酰铵凝胶、聚乙烯醇凝胶等，一般强度较好，但传质性能较差，包埋后对细胞活性有影响。常用的微生物固定化方法一般来说，大致可以分成吸附法、共价结合法、交联法和包埋法四大类，本研究采用的是包埋法。 由于乳酸菌的培养增殖难度高、对外抵抗力差，在运输、储藏和应用过程中大量死亡，严重影响了微生态制剂的效能。因此为了提高乳酸菌应用的方便性与时效性，就要采用不同的包埋法对乳酸菌进行固定化 7。由于琼脂的硬度较差，聚丙烯酰胺凝胶具有毒性，明胶内部结构密实但是传质性能差，而海藻酸钠凝胶的机械强度和传质性能都较好，并且对生物无毒性，抗生物
13、分解性良好，是比较合适的固定化细胞载体。采用海藻酸钠做包埋剂，氯化钙做成型剂及硬化剂，用3 医用注射器挤压来制备乳酸菌凝胶珠。通过测定其活菌数，对海藻酸钠及氯化钙的浓度进行研究，确定海藻酸钠包埋乳酸菌的工艺条件。 1.4 本研究的目的和意义 乳酸菌 是乳品发酵菌种 之一 ，也是益生菌制剂的主要菌种之一。现多用于添加到传统不同类型食品中作为发酵剂，如发酵乳、奶酪等，以及 功能性食品、饲料中的添加剂。而目前生产所用乳酸菌一般都需经多次活化和多次扩大培养制成生产发酵剂后才能使用。嗜热链球菌获得的过程既费时又费工，极不方便 ， 包埋则 是提高细菌活性的一种有效方法，将细菌包埋在保护性结构中，能增强细菌
14、对极端条件的抗性，提高细菌在体系中的存活率。为了提高生产制作工艺的方便性与时效性，本研究采用海藻酸钠包埋法对 嗜热链球菌 进行固定化， 嗜热链球菌 菌种均匀地包埋在载体中，使细菌细胞中的酶处于原始活性状态，使乳酸菌的储存，运送以及加工过程酶活性提高，活力增强，耐持久性增加，为乳酸菌作为发酵菌种、作 为益生菌添加剂的使用建立一个良好的基础 8。 2 材料和方法 2.1 材料与仪器设备 2.1.1 试剂 本研究所用试剂如表 1 所示 。 表 1 主要实验试剂 名称 厂商 吐温试剂 （杭州微生物试剂有限公司） 磷酸氢二钾 （天津永达化学试剂开发中心） 磷酸氢钠 （浙江中星化工试剂有限公司） 氯化钠
15、（浙江三鹰化学试剂有限公司） 海藻酸钠 （杭州微生物试剂有限公司） 氯化钙 （杭州微生物试剂有限公司） 牛肉膏 （浙江三鹰化学试剂有限公司） 酵母浸膏 （浙江中星化工试剂有限公司） 抗环血酸 （ 天津永达化学试剂开发中心） 膦酸甘油二钠 （杭州微生物试剂有限公司） 无水氯化钙 （上海市奉贤奉城试剂厂） 2.1.2 仪器设备 4 本研究所用仪器如表 2 所示 。 表 2 主要实验仪器 仪器名称 仪器型号 电子天平 HZX-A100 型 磁力搅拌器 HJ-1 型 超净工作台 SW-CJ-2FD 型 恒温培养箱 FRH-128 型 高压灭菌锅 YXQ-50LS-SII 型 光学显微镜 XSD-SM2
16、 型 2.2 实验方法 2.2.1 培养基及溶液的配制 2.2.1.1 M17 培养基 称取胰蛋白 胨 5.0g，牛肉膏 5.0g，大豆蛋白胨 5.0g，酵母浸膏 2.5g，抗坏血酸 0.5g，硫酸镁 0.25g，磷酸甘油二钠 19.0g，乳糖 5g，琼脂 20 g，分别溶于一定量蒸馏水 1000mL，溶解加热混匀后配制成溶液。再用氢氧化钠调节 pH 至6.90.2。然后在 121 下用高压蒸汽灭菌锅灭菌 15min，等到冷却后倒入平板备用。 2.2.1.2 缓冲液的制备 称取磷酸二氢钾 0.5g，磷酸氢二钠 0.48g，氯化钠 0.75g，吐温 80 0.05g 放入蒸馏水 100 毫升中混
17、匀，制作成缓冲液备用。 2.2.1.3 海藻酸 钠的配制 称取海藻酸钠 1g 放入 100mL 蒸馏水中，加热搅拌使其充分溶解混匀，冷却至室温后备用。再称取 2g、 3g、 4g、 5g 的海藻酸钠，用同样方法制成不同浓度的溶液备用。 2.2.1.3 氯化钙溶液的配置 称取无水氯化钙 35g，放入 1000mL 蒸馏水中充分搅拌溶解，制成溶液备用。再称取 2g、 4g、 6g、 8g 氯化钙用同上方法制成不同浓度氯化钙溶液备用。 2.2.1.4 蔗糖溶液的配制 称取蔗糖 500g，放入 1000mL 蒸馏水中加热搅拌使其充分溶解，冷却到室温后备用。 2.2.1.5 生理 盐水的配制 5 称取氯
18、化钠 10g，放入 1000mL 蒸馏水中震荡充分溶解，封口后放入灭菌锅中 121 灭菌 15 分钟，冷却到室温后备用。 2.2.2 嗜热链球菌 的分离 取市场上买的光明乳业酸奶 10mL 放入无菌三角瓶中，并加入 90mL 无菌生理盐水，充分溶解混匀制成菌夜。从三角瓶取出 1mL 菌液，放于一试管中，再加入 9mL 无菌生理盐水。从试管中取出 1mL 菌液，放到另一个试管中，再加入9mL 无菌生理盐水，如此再稀释 1 次 9。从每个试管中取菌液分别涂布于配置好的 M17 琼脂培养基平板平板上，稀释菌液放置于冰箱中 备用， M17 平板放到恒温培养箱（ 371） 中培养 24h 天。用接种环从
19、培养好的培养皿中挑出嗜热链球菌（嗜热链球菌在平板上的形态为半湿润表面光滑），画线到配置好的 M17 培养基平板上，然后把 M17 平板放到恒温培养箱（ 371） 中第二次培养 24h 天等待计数 10。把培养好的菌种挑出制作成玻片进行革兰氏染色，然后镜检观察嗜热链球菌菌种。 2.2.3 革兰氏染色 在载玻片上滴一滴蒸馏水，用接种环挑取菌种放入玻片上的蒸馏水中。在酒精灯下烘烤（玻片温度不能过高避免烧死所选菌种）使水分蒸干，固定好菌种。滴入结晶紫 染色 1 分钟，用自来水冲洗。再加碘液覆盖涂面染 1 分钟，用自来水冲洗，吸水纸吸取水分。之后用酒精脱色约 30 秒，吸去水分。再滴入番红复染1 分钟，
20、用自来水冲洗 11-12。待干燥后镜检。 2.2.4 菌种保藏 选用两种不同保藏方法。一是液体石蜡保藏法：将液体石蜡装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎， 121 灭菌 30 分钟，然后放在 40 恒温箱中，使水汽蒸发掉备用。将嗜热链球菌在最适宜的斜面培养基中培养，得到健壮的菌体。用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，用量以高出斜面顶端1 厘米为准，使菌种与空气隔 绝。将试管直立，放置在低温下保存。二是斜面低温保藏法：将嗜热链球菌接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，用棉塞部分用油纸包扎好，移至 2-8 的冰箱中保藏 13。 2.2.5 嗜热链球菌 包埋 6 将培养
21、48h 的嗜热链球菌制备成 106cfu/mL 左右的菌悬液，将 3mL 悬液加入温度适当的海藻酸钠溶液和 50%蔗糖溶液，用磁力搅拌器充分搅拌 15 分钟(250r/min)，用医用注射器注入氯化钙无菌溶液中成型，捞出后在氯化钙溶液浸泡 5-10min 进行硬化处理，完成后捞出凝胶珠，用无菌生理盐水冲洗 3 次，洗 去凝胶珠表面的氯化钙。最后将形状均匀的圆型凝胶珠装入无菌的磨口小瓶中，放置于 4 中备用 14。 2.2.6 平板稀释计数 取菌悬液 0.1mL 在 M17 培养基上进行涂布， 37 恒温培养 24h 后计活菌数。 2.2.7 包埋凝胶珠的溶解 秤取 1.0g 凝胶珠样品溶于 9
22、mL 缓冲液中，先以磁力搅拌器充分搅拌将包埋的菌体溶出，然后取 0.1mL 菌液在 M17 培养基上进行涂布， 37 恒温培养 24h之后计活菌数。 2.2.8 包埋率计算 活菌率为所选单位重量 (1g)产品中所包埋的活菌数。 活菌率 (cfu/g)=(一定稀释度下的活菌数 稀释倍数 总液量 )/样品的量。 包埋率 (%)=产品总活菌数 /包埋时所用菌悬液总菌数。 2.2.9 包埋条件的研究 2.2.9.1 海藻酸钠浓度对包埋率的影响 分别配制浓度为 1%、 2%、 3%、 4%、 5%的海藻酸钠溶液，在氯化钙浓度为1%，注射器大小为 5mL 时进行包埋。然后溶解凝胶珠进行涂布平板培养，之后分别计算其包埋率。 2.2.9.2 CaCl2 浓度对包埋率的影响 分别配置浓度为 0.5%、 1.0%、 1.5%、 2.0%的氯化钙溶液，在海藻酸钠浓度为 4%，注 射器大小为 5mL 时进行包埋。然后溶解凝胶珠进行涂布平板培养，之后分别计算其包埋率。 2.2.9.3 凝胶珠大小对包埋率的影响
