1、 1 本科毕业论文（设计） 论文题目： 桑叶提取物抗氧化活性的研究 所在学院 生物与环境学院 专业班级 食品 质量 与 安全 学生姓名 学号 指导教师 职称 指导教师 职称 完成日期 年 月 日 摘 要 本文 研究 的是桑叶的水、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、余相这 6 种提 取物 的抗氧化活性 。采用分光光度法测定了 6 种提取物对超氧自由基、羟基自由基、二苯代苦味酰基自由基 (DPPH )、 卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸过氧自由基 的清除和抑制的能力，并以抗坏血酸作为对照。结果表明：桑叶正丁醇提取物在 4 种自由基清除实验中清除能力最强，清除效果平均在 50%左右，其次是乙酸乙酯。正丁醇提取物
2、清除卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸过氧体系抗氧化能力高达 66%，并超过抗坏血酸。 石油醚和余相提取物在清除 4 种自由基中效果不明显。在清除羟基自由基中乙酸乙酯提取物效果最好。 关键词： 桑叶；分光光度法；自由基；正丁醇ABSTRACT The antioxidant activity of six extracts from mulberry leaves in water, Alcohol,Petroleum ether,Ethyl acetate,Butanol and Surplus was studied in this paper.The clearance and inhibition
3、 ability of the six extracts to superoxide radical, hydroxyl radical, DPPH and Peroxy radical unsaturated fatty acid in the yolk lipoprotein system were measured by using spectrophotometry, and the control group was ascorbic acid.The results showed that:Butanol showed the best in the experiment of c
4、leaning four free radicals, and Ethyl acetate was just behind it.the abilities to clean oxidation resistant yolk lipoprotein fatty acid peroxy system of Butanol extract from mulberry leaves revealed the most effective action, the results was 66% and exceed the ascorbic acid.The extract from Petroleu
5、m ether and Surplus didnt showed an obvious effectiveness in the facts of four free radicals,but Ethyl acetate indicated an effectual impact on cleaning hydroxyl radical. Keywords:Mulberry leaves;Spectrophotometric method; Radical; Butanol 目 录 1 前言 . 1 2 材料与方法 . 2 2.1 实验材料 . 2 2.1.1 实验仪器 . 2 2.1.2 实
6、验试剂 . 2 2.2 实验方法 . 3 2.2.1 桑叶水提取物的 制备 . 3 2.2.2 其他提取物的 制备 . 3 2.2.3 桑叶 提取物 清除超氧自由基的测定 . 3 2.2.4 桑叶 提取物 清除羟基 自由基 的测定 . 3 2.2.5 桑叶 提取物清除 DPPH 自由基 的测定 . 4 2.2.6 桑叶 提取物 对卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸过氧体系中抗氧化的测定 . 4 3 结果与分析 . 4 3.1 超氧自由基清除能力 . 4 3.2 羟基 自由基清除能力 . 5 3.3 DPPH 自由基清除能力 . 5 3.4 卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸过氧体系中抗氧化 的能力 . 6 4 结 论
7、 . 7 参考文献 . 8 致谢 . 10 1 1 前言 我国是世界上最大的桑树种植国，桑树在我国已有 4000 多年的栽培历史。桑树原产于中国和朝鲜，全球约有 l6 种，分布于北温带、亚热带和非洲热带及美洲地区。我国目前有几百万亩桑园，主要有家 桑或白桑、鸡桑、华桑、蒙桑、山桑、长果桑等 10 多个种和变种。桑叶是桑树的主要产物，约占地上部产量的 64%，每年可摘 36 次，在我国有着极大的资源优势。桑叶营养丰富，含有人体所需的 18 种氨基酸、 7 种维生素，还含有锌、锰、钙、铁等微量元素，已被国家卫生部正式列入“既是食品又是药品”资源名单，并且具有降血压、血脂、抗炎等作用。大量研究表明，
8、桑叶不仅含有丰富的氨基酸、维生素、矿物质等营养物质，而且富含多种功能性成分。黄酮类化合物是桑叶的主要功能性成分之一，包括芸香苷、槲皮素、异槲皮素、二氢山萘素等，含量约占干叶重的 1.0%3.0%，是所有植物茎叶中含量较高的一种。桑叶中的黄酮类化合物是天然的抗氧化剂，可清除人体中超氧离子的自由基，具有抑制血清脂质增加和抑制动脉粥样硬化形成的作用 1-4。 近年来对桑叶药效 5的研究主要集中在以下方面：降血糖。通过对糖尿病模型的大鼠的研究，桑叶及桑叶水提物具有降糖作用，可预防或阻滞 I 型糖尿病的发展。其降血脂的作用。桑叶可有降低患者的 VLDL 胆固醇、 LDL 胆固醇、甘油三酯、总胆固醇的作用
9、。增加HDL 胆固醇的作用，可抑制动脉粥样硬化。 槲皮素 -3-氧葡萄糖甙 、芦丁和异槲皮苷是桑叶主要的抗 LDL 氧化活性成分。抗氧化。桑叶可以清除氧自由基，具有抗氧化作用。抗衰老。抗癌 6-10 。 自由基性质活泼，对蛋白质、脂质、核酸等有损伤性。 OH 对细胞的危害更大。在正常生理状态下，氧自由基一般都处于激活状态，产生与清除能力处于平衡，但在病理状态下，平衡被破坏，导致机体（如细胞膜和大分子）出现损伤。许多疾病如动脉粥样硬化、心脑血管疾病、肝脏的化学毒性反应、衰老、休克、炎症等病理现象都直接或间接地与自由基有关。 本文利用体外清除自由基评价体系对桑叶的抗氧化能力进行较系统的研究，以抗坏
10、血酸作为对 照，从多种自由基评价桑叶提取物的抗氧化活性的抗氧化能力。 2 材料与方法 2.1 实验 材料 2.1.1 实验仪器 表 1 实验仪器 仪器名称 型号 生产厂家 数显恒温水浴锅 HH-4 国华电器有限公司 电子平台 BS 224S 赛多利斯 离心机 5810R 艾本德 旋转蒸发器 Rt-1201C 巩义市予华仪器有限公司 分光光度计 UV-3200PCS 上海 美普达 仪器有限公司 2.1.2 实验试剂 材料：桑叶（购于中药房） 表 2 化学试剂 试剂名称 等级 产地 95%乙醇 分析纯 国药集团 石油醚 分析纯 国药集团 乙酸乙酯 分析纯 国药集团 2 正丁醇 分析纯 杭州高晶精细
11、化工有限公司 磷酸缓冲液 分析纯 天津博迪化工有限公司 三氯乙酸 分析纯 国药集团 抗坏血酸 分析纯 国药集团 焦性没食子酸 分析纯 国药集团 邻菲罗啉 分析纯 天津博迪化工有限公司 2-硫代巴比妥酸 分析纯 国药集团 30%过氧化氢 分析纯 杭州高晶精细化工有限公司 Tris-HCL 缓冲液 分析纯 国药集团 1.1-二苯基 -2-三硝基苯肼 分析纯 国药集团 2.2 实验方法 2.2.1 水提 物的制备 称取桑叶粉碎样品 5g，加 200mL蒸馏水于 70水浴浸提 2h后过滤，得到桑叶水提 物 。 2.2.2 其他提取物的制备 称取桑叶粉碎样品 5g，加 200mL浓度 70%的乙醇于 7
12、0水浴浸提 2h后过滤，收集部分滤液，剩余分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次进行萃取，收集提取物相。 图 1 其他提取物萃取流程 2.2.3 桑叶提取物清除超氧自由基的测定 配制 pH=8.2， 50nmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸（ Tris-hcl）缓冲液。准确量取 2.8mL的缓 冲液， 0.1mL的蒸馏水于试管中，为空白组第一组；量取 2.8mL的缓冲液， 0.1mL的 0.2mg/mL抗坏血酸与试管中，为对照组第二组；量取 2.8mL的缓冲液， 0.1mL桑叶的 6种提取物于试管中，为样品组第三组。在 420nm下测吸光度（ A）前迅速加入 0.1mL的 60mmol/L的邻苯三酚
13、，每个处理重复 3次，取其平均值 。 超氧自由基清除率计算公式 11： 抑制率 (%)= %1 0 0 对照空白 对照样品对照空白 ）（）（ KK KKKK2.2.4 桑叶提取物清除羟基自由基的测定 所有试管 中加入 0.1mol/L pH=7.4 的磷酸缓冲液（ PBS） 5.0mL。样品管中，分别加入 0.2mL桑叶的 6 种提取物， 1.8mL 的蒸馏水， 1.0mL 的邻二氮菲， 1.0mL 的 Fe2SO4， 1.0mL 的 H2O2；样参管中，加入 0.2mL 桑叶的 6 种提取物， 4.8mL 的蒸馏水；损伤管中，加入 1.0mL 的邻二氮菲， 1.0mL 的 Fe2SO4， 2
14、.0mL 的蒸馏水， 1.0mL 的 H2O2；未损伤管中，加入 1.0mL 的邻二氮菲， 1.0mL 的 Fe2SO4， 3.0mL 的蒸馏水；空白参照管中，加入 5.0mL 的蒸馏水；再对所有试管中加入 0.1mol/L pH=7.4 的 PBS 5.0mL。 每个处理重复 3 次，取其平均值 。 羟基自由基清除率计算公式 12： 石油醚相 余相 正丁醇萃取 石油醚萃取 乙酸乙酯萃取 石油醚提取物 乙酸乙酯 提取物 乙醇 提取物 正丁醇相 乙酸乙酯相 3 清除率 ( %)= %100 损伤未损伤 样参样品空参损伤 ）（）（ AA AAAA2.2.5 桑叶提取物清除 DPPH自由基的测定 先
15、用无水乙醇配制 0.1mol/L 的 DPPH 溶液，配好后应避光保存。准确量取 2mL 的 DPPH和 2mL 的无水乙醇于试管中，作为第一组 （ Ac)；同样准确量取 2mL 的 DPPH 和 2mL 的桑叶提取物 样品于试管中，为第二组 (At)；最后准确量取 2mL 桑叶 提 取物 样品 和 2mL 的无水乙醇于试管中，作为第三组 (Ab)。将加好的试管同时静置 30min，于 517nm 下测吸光度（ A）值，并且每个处理重复 3 次，取其平均值 13。 DPPH 清除率计算公式 14： 清除率 ( %)= %100)1( cbt A AA 2.2.6 桑叶提取物对卵黄脂蛋白不饱和脂
16、肪酸过氧体系中抗氧化活性的测定 选用 1： 25 的卵黄悬液，吸取此液 1mL 于带塞刻度试管中，然后分别加入不同的桑叶提取物 溶液 0.5mL，加入 25mmol/L的 FeSO4 溶液 1mL，用 0.1mol/L pH=7.4的 PBS补充至 10mL，在 37 下培养 12h，取出后加入 1mL20%三氯乙酸（ TCA），静置 10min 后，以 3500r/min 离心 10min，吸取离心上清液 4mL 加入 2mL 0.8%的硫代巴比妥酸（ TBA），加塞后置于沸水浴中 15min，冷却后在 532nm 下比色测定吸光度值 A，空白管不加 提取物 ，以蒸馏水代替，其他的都相同，对
17、照管以维生素 C 为标准抗氧化剂。每个处理重复 3 次，取其平均值 。 桑叶提取物及维生素 C 对 卵黄脂蛋白脂质过氧化的清除率： 清除率 ( %)= %100ooA AA 3 结果与分析 3.1 超氧自由基清除能力 用邻苯三酚自氧化体系产生 超氧阴离子 ， 每 0.5s 记录分光光度计显示的吸光度值，记录 5s，计算出斜率（ K），根据 超氧自由基抑制率计算公式，得出 6 种 提取物 的 清除 率如图所示。可以看出正丁醇 提取物相对于桑叶其余提取物清除能力最强，但 抗坏血酸的 清除 率最高 。余相的清除能力很差，原因可能是由于正丁醇将大部分抗氧化物质萃取出来，致使余相没有剩余导致的结果。 图
18、 2 超氧自由基清除能力 4 3.2 羟基自由基清除 能力 H2O2/Fe2+体系可通过 Fenton 反应产生 OH，使邻二氮菲 -Fe2+水溶液 (红色 )氧化为邻二氮菲 -Fe3+ (褪色 )，以此测定 OH 量的变化，实现抗氧化剂清除自由基能力的测定 15。从图中可以看出 桑叶 6 种提取物中只有乙酸乙酯提取物略高，超过 50%。余相的结果可能是上述分析所解释的原因，而石油醚提取物清除能力不佳，可能是由于石油醚萃取的物质抗氧化能力不强或者浓度低所致。 图 3 羟基自由基清除能力 3.3 DPPH 自由基清除能力 DPPH 是一种早期合成的有机自由基，常用于 评估抗氧化物的供氢能力。还原
19、力测定是一种评价抗氧化剂活性的方法，能够检验样品能否作为良好的电子供体，其还原能力与抗氧化活性之间有显著的相关性 16-19。从下图结果可看出，桑叶 6 种 提取物 的 DPPH 自由基清除能力均低于抗坏血酸，但是乙醇、乙酸乙酯、正丁醇 提取物均有一定的 清除能力。 图 4 DPPH 自由基清除能力 3.4 卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸过氧体系中抗氧化的能力 硫代巴比妥酸法是基于不饱和脂肪酸通过自由基反应，形成氧化自由基而氧化生成环氧化合物，随后分解与硫代巴比妥酸作用生成 TBA 配合物，配合 物的多少是衡量自由基氧化反应进行程度的标志。 在对脂蛋白脂质抗氧化能力中，抗坏血酸只有 56%， 但 正丁
20、醇 高于抗坏血酸， 达到 66%， 原因可能是由于卵黄是脂溶性体系，而抗坏血酸是水溶性，在脂溶性体系中抗坏血酸分散不均匀所致。 5 图 5 卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸过氧体系中抗氧化的能力 4 结论 本文通过用分光光度计测桑叶 6 种提取物对上述 4 种自由基的清除作用。经过本实验，得出了以下结论： (1)桑叶中物质具有一定的抗氧化能力，且桑叶不同提取物对不同的自由基具有不同的清除效果 ,这可能是由于在桑叶不同提取物中所含主 要化学成分不同 ,从而导致了清除能力不同。 (2)综合表现中桑叶正丁醇提取物清除能力在桑叶 6 种提取物中最强，平均能达到 50%，而在卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸过氧体系的抗氧化
21、能力高达 66%，并强于抗坏血酸。清除能力其次是乙酸乙酯提取物，而石油醚和余相提取物清除能力很差，为 10%或者更低。 根据文献可知桑叶 的抗氧化性是与桑叶中黄酮类、酚类、生物碱和氨基酸等多种活性成分有关 20，具体桑叶中的化学成分与抗氧化性的构效关系还有待进一步研究。 6 参考文献 1 Katsube T,Imawaka N,Kawano Y,et.al.Antioxidant flavonol glycosides in mulberry(Morus alba L)leaves isolated based on LDL antioxidant activityJ.Food Chem,20
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