1、 本科毕业论文（设计） 论文题目： 温度对恶臭假单胞菌生物学特性的影响 所在学院 生物与环境学院 专业班级 环境科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 日 摘 要 本 研究 开展培养温度对恶臭假单胞菌生物学特性的影响研究，包括不同培养温度下产酶特性、外膜蛋白和脂多糖种类 与 产量等。选取 4 -30 范围内 5 个不同温度进行培养，测定上清液及胞内产物的产酶特性，结果只有用杯碟法测得在25 下产胞内淀粉酶，其它蛋白酶、磷脂酶、尿酶等在所有温度下均未检测到；以十二烷基肌氨酸 钠 法提取菌株外膜蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE检测主要条带的差异， 15 培养的菌体外膜
2、蛋白 与另两种培养温度谱带相比表现出差异性，出现分子量约 26kDa 的特征谱带； 随着培养温度的升高 所产 外膜蛋白含量增加；采用酚水法提取脂多糖， SDS-PAGE 后银染，检测了分子量和主要条带的差异，结果显示 随培养温度的升高，出现更高分子量的特征谱 带，粗提脂多糖中蛋白质含量也随培养温度升高而增加。 研究结果为 阐明恶臭假单胞菌不同温度条件下的致病机理提供了部分基础。 关键词： 恶臭假单胞菌 ； 胞外酶 ； 胞内酶 ； 脂多糖 ； 外膜蛋白 ABSTRACT In this study, carried out the incubation temperature on the bi
3、ological characteristics of Pseudomonas putida, including the characteristics of different incubation temperature for enzyme production, outer membrane proteins and lipopolysaccharide types and yield, etc. Select five different temperatures within the range of 4 -30 were cultured in the determinatio
4、n of characteristics of the products in the supernatant and intracellular enzyme production, the results only using the cylinder plate method at 25 producing extracellular amylase, other protease, phospholipase enzymes, urinary enzymes were not detected at all temperatures; By Sarkosyl method to ext
5、ract the strain outer membrane protein by SDS-PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis to detect differences of the main bands, 15 culture of the bacterial outer membrane protein and the other two training temperature bands compared to the performance of a business trip the opposite sex, there the c
6、haracteristic bands of the molecular weight of about 26kDa; with cultivation temperature increases the outer membrane protein content increased ; the use of water-phenol method to extract LPS, silver staining after SDS-PAGE to detect the differences of molecular weight and the main strip, the result
7、s show with incubation temperature, the characteristic bands of higher molecular weight, the crude LPS in the protein content increased with incubation temperature increases. The results provided some basis to clarify the pathogenic mechanism of Pseudomonas putida under different temperature conditi
8、ons. Keywords: Pseudomonas Putida; Extracellular enzyme; Intracellular enzyme; Lipopolysaccaride; Outer membrane protein I 目 录 1 前言 . 1 2 材料与方法 . 2 2.1 实验材料 . 2 2.1.1 菌株 . 2 2.1.2 试剂 . 2 2.1.3 主要 仪器 及型号 . 2 2.2 实验方法 . 3 2.2.1 培养基和溶液的配制 . 3 2.2.2 菌株的保藏 . 5 2.2.3 酶活性的分析 . 5 2.2.4 外膜蛋白的提取 . 6 2.2.5 脂多糖
9、的提取 . 7 2.2.6 SDS-PAGE . 8 3 结果与分析 . 8 3.1 产酶特性 . 8 3.1.1 不同平板中胞外产酶情况观察 . 8 3.1.2 杯碟法观察胞内产酶情况 . 9 3.2 不同培养温度的 Pt-01 外膜蛋白分析 . 9 3.3 不同培养温度的 Pt-01 脂多糖 特性 分析 . 11 4 讨论 . 13 参考文献 . 15 致 谢 . 17 1 1 前言 大黄鱼 (Pseudosciaena crocea)隶属于硬骨鱼纲、鲈形目、石首鱼科、黄鱼属 ，又名黄花、大鲜、黄瓜鱼、大黄花鱼 ， 为 暖温性近海集群洄游鱼类 ， 是我国传统“四大海产”之一的近海主要经济鱼
10、类 1。 近年来 ,浙江省大黄鱼养殖发展迅猛 ，特别是沿海的宁波象山 港 、台州大陈岛等海域 ， 网箱养殖大黄鱼已成为该地区的主要产业之一。但随着养殖业的发展 ， 病害日趋严重 2-5， 病害问题已成为该养殖业持续发展重要的制约因素之一。 2004 年春 , 浙江宁波象山港海区网箱养殖大黄鱼发生大量死亡 , 死亡鱼的体表正常 ， 解剖发现其脾脏和肾脏都有许多白点状结节。 2005 年 4 月 ， 在浙江台州深水网箱养殖大黄鱼中也发生同样症状的病例 , 经调查此病传染性强 ， 在自然状态下 的发病死亡率可达 70%-80%6。为了摸清引起大黄鱼内脏白点病的主要原因 ， 本实验室对 2011 年象
11、山港病鱼进行了病原分离、 理化特性测试， 并 经 16S rDNA 序列比对鉴定该致病菌为恶臭假单胞菌（ Pseudomonas putida） 7。已有报道表明，除大黄鱼外，恶臭假单胞菌能够引起多种 水产动物疾病，如欧洲 鳗鲡 8、罗氏沼虾 9、中华绒螯蟹 10等水产动物发病 ,甚至还能引起人食物中毒和败血症 11,12等，在公共 卫生方面尤其值得重视。 假单胞菌引起的疾病在世界各地的温水性或冷水性的海、淡水鱼中都可 能发生 , 是海水中的正常菌群 ,为条件致病菌，其致病性主要取决于鱼体的生理状态及水环境的理化条件。大量研究表明，革兰氏阴性菌如大肠杆菌（ Escherichia coli）、
12、霍乱弧菌（ Vibrio cholerae）、耶尔森氏菌（ Yersinia）、爱德华氏菌（ Edwardsiella）等的外膜蛋白 (Outer membrane Protein,OMP)是细菌的粘附素 13，在致病和免疫中起重要作用。 Merino 等 14曾报道温度影响嗜水气单胞菌外膜的组成成分和毒力 ,孙建和等采用 SDS-PAGE 技术研究发现 ，温度对嗜水气单胞菌外膜蛋白的表达量具有明显影响，但并未有新条带的增加 15。 Gonzalez-Serrano 等人 16也指出嗜水气单胞菌在不同温度下所表达的溶血素和细胞毒素的活性不同。任静等 17研究表明原料乳中嗜冷菌所产脂肪酶的最大酶
13、活力随培养温度的升高而升高。国外研究显示，在不同生长温度条件下，极地嗜冷菌生成的胞外蛋白酶量存在差异，但蛋白水解活性组分的组成却是一致的 l8,l9。革兰氏阴性菌胞壁上的脂多糖2 (lipopolysaccaride， LPS)是导致感染敷血症性休克发生的一系列毒性反应的 主要病源物。经不同培养时间提取哈氏弧菌的 LPS，在 0h-48h 内产量逐渐增加， LPS电泳图谱存在差异 20。温度条件还对菌株合成次生代谢产物有所影响。对于恶臭假单胞菌在不同温度的情况下的生物学特性尚知甚少。 本研究开展培养温度对恶臭假单胞菌生物学特性的影响研究，包括不同培养温度下产酶特性、外膜蛋白种类和脂多糖特性等
14、,旨在为阐明恶臭假单胞菌不同温度条件下的致病机理提供部分基础。 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 菌株 恶臭 假单胞菌菌株 Pt-01分离自 2011年象山港发病大黄鱼、 Pt-38、 593、 643、645、 1819、 1820、 1836、 1839、 2309购自中科院微生物所菌种保藏中心。 2.1.2 试剂 三氯乙酸、卢哥氏碘液、苯酚、 PBS 、 SDS、过硫酸铵、 Tris-Hcl、 TEMED、Acrylaymide、甲醇、甲醛、硫代硫酸钠、无水碳酸钠、硝酸银、醋酸、异丙醇、十二烷基肌氨酸钠等为国产分析纯，由上海生工生物技术有限公司提供。 2.1.3 主要 仪器
15、及型号 表 1 主要仪器及型号 仪 器 型 号 生产厂家 小型摇床 THZ-c-1 宁波江南仪器厂 -80 超低温冰 箱 NBS Premium 系列 u410 生泰科技有限公司 超声波细胞粉碎机 JY92-2D 新芝生物科技有限公司 高速冷冻离心机 5810R 上海肯强仪器有限公司 电泳仪 DYY-11 北京市六一仪器厂 3 数显恒温水浴锅 单列 3 孔 长风仪器 高速冷冻离心机 GL-21M 上海离心机械研究所 立式压力蒸汽灭菌锅 LDZH-150KBS 上海申安医疗器械厂 生化培养箱 SPX 型智能 宁波江南仪器厂 琼脂糖 水平电泳槽 DYY- 北京市六一仪器厂 多功能酶标仪 Syner
16、y HT 美国 BioTek 公司 2.2 实验方法 2.2.1 培养基和溶液的配制 LB 液体培养基： Nacl 1.00g 蛋白胨 1.00g 酵母提取物 0.5g 蒸馏水 100mL pH 7.0 灭菌： 121 ,20min LB 固体培养基： Nacl 1.00g 蛋白胨 1.00g 酵母提取物 0.5g 琼脂粉 1.5-2.0g 蒸馏水 100mL pH 7.0 灭菌： 121 ,20min 奶粉固体培养基（ 100mL） ： 1%脱脂奶粉（ 1g） (加 50mL 水 )115 ,20min 灭菌，与已灭菌还未冷却的 LB 固体培养基（ 50mL）在无菌室混匀倒平板。 酪蛋白固体
17、培养基： 酪蛋白 0.4g Nacl 1.00g 蛋白胨 1.00g 酵母提取物 0.5g 琼脂粉 1.5-2.0g 4 蒸馏水 100mL pH 7.0 灭菌： 121 ,20min 在配制过程中，酪蛋白很难溶解，需要事先加入 1%左右的 NaOH 固体， 50-60下加热搅拌才能溶解。 淀粉固体培养基： 淀粉 0.2g Nacl 1.00g 蛋白胨 1.00g 酵母提取物 0.5g 琼脂粉 1.5-2.0g 蒸馏水 100mL pH 7.0 灭菌： 121 ,20min 吐温 -80 固体培养基： 吐温 -80 1mL Nacl 1.00g 蛋白胨 1.00g 酵母提取物 0.5g 琼脂粉
18、 1.5-2.0g 蒸馏水 100mL pH 7.0 灭菌： 121 ,20min 尿素固体培养基： 尿素 2g Nacl 1.00g 蛋白胨 1.00g 酵母提取物 0.5g 琼脂粉 1.5-2.0g 蒸馏水 100mL pH 7.0 灭菌： 121 ,20min 10%三氯乙酸溶液： 10g 三氯乙酸用蒸馏水定容至 100mL； 生理盐水： 4.5gNacl， 500mL 蒸馏水； 5 90%苯酚： 90mL 纯苯酚， 10mL 蒸馏水； 0.05mol/L 的磷酸盐缓冲液： 0.272gK2HPO4， 1.074gNa2HPO41 2H2O， 100mL 蒸馏水； PBS(pH 7.4，
19、 0.0lmol/L )： NaCl 8g， KCl 0.2g， Na2HPO412H2O 2.9g， 1L 蒸馏水，调 PH 值至 7.4； 10%SDS： 0.1gSDS,1000L蒸馏水 ； 10%过硫酸铵溶液： 0.05g 过硫酸铵， 600L蒸馏水； 分离胶： 3.3mLH2O ， 4.0mL30%Acry laynide ， 2.5mL1.5MTris-Hcl(pH8.8)，0.1mL10%SDS， 0.1mL10%过硫酸铵， 10uLTEMED； 浓缩胶： 3.4mL 蒸馏水， 0.83mL30%Acry laynide,0.63mL1.0MTris-Hcl (pH6.8)，0.
20、05mL 10%SDS， 0.05mL10%过硫酸铵 ,0.01mLTEMED； 甲醛固定液： 20mL 甲醇， 25L37%甲醛，定容至 50mL； 硫代硫酸盐显影液： 1.5g 无水碳酸钠， 100uL 2g/L 硫代硫酸钠， 25L37%甲醛，定容至 50mL； 0.1%硝酸银 :用室温下密封于棕色瓶中的 20%母液新鲜稀释而成； 20mmol/L 的 Tris-Hcl缓冲液：称 2.42gTris 置于 1L烧杯中，加入约 800mL 蒸馏水充分搅拌溶解，用浓盐酸调 pH 至 8.0，加水定容至 1L； 0.5%十二烷基肌氨酸的 Tris-Hcl 缓冲液： 0.5g 十二烷基肌氨酸溶解
21、于 100mL 已配置好的 Tris-Hcl缓冲液中。 2.2.2 菌株的保藏 将购置的菌株分别接种到 LB 固体培养基上放在 28培养箱中培养 12h，置4暂存，作为工作菌株。 2.2.3 酶活性的分析 （ 1） 菌株的胞外酶活性检测 分别配制含酪蛋白（ 0.4%）、淀粉（ 0.2%）、吐温 -80（ 1.0%）、尿素（ 2.0%）、奶粉（ 1.0%）的 LB 琼脂平板各 50 个，将上述 10 种恶臭假单胞菌 菌株划线或点种于含上述底物的 LB 琼脂平板上（每株菌划一种平板 5 个），将平板分为 5 组6 放在 5 个不同的温度 4 、 15 、 20 、 25 、 30下培养 （一组中含
22、 Pt-01：酪蛋白、淀粉、吐温 -80、尿素、奶粉； Pt-38：酪蛋白、淀粉、吐温 -80、尿素、奶粉；依此类推一种菌对应 5 种不同的平板），培养到长出菌体后，向酪蛋白平板中加入 10%三氯乙酸溶液，向淀粉平板中加入卢哥氏碘液，观察平板是否出现透明圈或不透明圈或变成红色。 （ 2） 胞内产物酶活性的分析 胞内酶粗提液的制备 ：用牙签将恶臭假单胞菌 Pt-01、 Pt-38、 593、 643、 645、1819、 1820、 1836、 1839、 2309 菌株分别接种到 10 个装有 5mL LB 液体培养基的试管中，这 10 支试管为一组，共接种 5 组，将这 5 组分别放在 5
23、个不同温度4 、 15 、 20 、 25 、 30 摇床振荡培养直到菌体长出。用移液枪吸取试管中的菌液到 2.0mLEP 管中， 8000r/min 离心 10min（若菌体很少，再往各 EP 管中加相应的试管菌液，再去离心使 EP 管中离心后菌体尽量多），上清液为胞外物质，倒去上清液，菌体用 1mL 的 0.05mol/L 的磷酸盐缓冲液悬浮清洗，再离心10min，这样反复清洗菌体 3 次，倒去上清液，再加入 300L的磷酸盐缓冲液将菌体悬浮混匀，悬浮细胞在 JY92-2D 型超声波细胞粉碎机上破碎，破碎条件：温度 4 左右，输出功率 400W，时间 3min(破碎 8s 间隔 4s)。细
24、胞破碎后经8000r/min 离心 30min。取上清液到 EP 管中作为无细胞胞内酶粗提液置于 -18冰箱中冻存备用。 杯碟法测定酶活性： 分别配制含酪蛋白（ 0.4%）、淀粉（ 0.2%）、吐温 -80（ 1.0%）、尿素（ 2.0%）、奶粉（ 1.0%）的 LB 琼脂平板，将 EP 管中溶液加于平板上放置的无菌小杯中，放在 5 个不同温度 4 、 15 、 20 、 25 、 30 的培养箱中培养后，取出小杯，向酪蛋白平板中加入 10%三氯乙酸溶液，向淀粉平板中加入卢哥 氏碘液，观察平板是否出现透明圈或不透明圈或变成红色。 2.2.4 外膜蛋白的提取 以 三种温度 15 、 22 、 30 培养菌体， 提取外膜蛋白： 将恶臭假单胞菌Pt-01 接种到 100mL LB 液体培养基中 ， 30 培养 12h 获得对数生长 期 的菌体，分别取等量（ 5mL）对数生长的菌体到 3 个 300mL 的 LB 液体培养基中放在不同的温度下 经 培养 相同的时间 18h， 分别将不同温度下的菌液 5000r/min 离心 20min收集菌体，用 20mmol/L 的 Tris-Hcl（ pH8.0）缓冲液洗涤 2 次，取沉淀加 20mmol/L
