1、毕业设计开题报告 应用化学 大豆异黄酮提取及体外清除自由基研究 一、 选题的背景和意义 大豆是我国主要的粮食作物，营养丰富。古今中外的医学书籍中将大豆列为能使人类长寿的首要食品。明代著名医学家李时珍认为食服大豆令人长肌肤 ,益颜色、填骨髓 , 加气力 ,补虚能食、能宽中益气、和脾胃。现代流行病学调查进一步提示经常食用大豆的人群具有较低的冠心病患病率和死亡率。大豆中富含各种营养物质，比如：大豆蛋白、大豆异黄酮、大豆卵磷脂，大豆多糖，大豆皂苷，大豆膳食纤维，以及人体必需的微量元素、维生素等。 大豆异黄酮是大豆中一类多酚化合 物的总称，是一类具有广泛营养学价值和健康保护作用的非固醇类物质。大豆异黄酮
2、是大豆生长过程中形成的次级代谢产物，主要分布在大豆种子的胚轴和子叶，胚轴中含量为 1% 2%，子叶含量为 0.1 % 0.3%。自然界中大豆异黄酮的资源十分有限，仅存于豆科蝶形花亚科的极少数植物中，大豆是唯一在营养学上有意义的食物资源。 我国是大豆生产大国，是非转基因大豆的故乡，我国开发大豆异黄酮及其在药品、保健品、食品上的应用具有很大的优势。从 2000 年起，国内开始有企业进行大豆异黄酮的生产。近年来，大豆异黄酮多样而突出的生物活性引起了 国内外研究人士的广泛关注。目前，我国已形成了稳定、高效、成熟的大豆异黄酮生产工艺，已有数十种大豆异黄酮提取的专利技术与生产工艺。全国从事大豆异黄酮提取的
3、正规企业有百余家，大部分企业能提取 5% 90%不同纯度，满足不同需求的大豆异黄酮。 异黄酮因具有弱的雌激素样作用，且能促进动物生长，抑制癌细胞生长，改善动脉血管柔软性，除以上生物活性作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等方面也有显著效果而格外受人关注。研究认为人体中的活性氧和自由基是引发衰老、癌变和细胞损伤的重要原因。筛选新的能够清除自由基的抗氧化天然药 物成为研究热点，黄酮作为高效，低毒，在我国资源丰富的天然抗氧化剂，对其抗氧化作用的研究自然成为人们关注的焦点。 1 因此，本次试验希望以发芽大豆为原料， 通过热浸提以及微波辅助萃取法，提取大豆异黄酮，以染料木素评价其含量，并利用大孔树脂
4、分离纯化，获得大豆异黄酮，定性分析大豆异黄酮在体外对自由基的清除能力，并研究其对亚硝胺合成的阻断作用和对亚硝酸盐的清除作用，对亚硝化反应的抑制作用。 用消除自由基能力来表示抗氧化活性的方法有 DPPH 法、 Fenton 反应体系法、 氮蓝四唑 (NBT)光化合还原法、邻苯三酚自氧化法、抗坏血 酸 Cu2+-H2O2 体系法等。从而获得实验 数据证明大豆能起到一定的抗衰老的作用以及其他的保健功效。 以便生产出具有治疗特异性高、高效、低毒的药品和天然保健品，同时有利于探索发现研究先进的提取分离方法，加速植物资源的有效开发利用。 二、 研究目标与主要内容 （含论文提纲） 本实验利用已有的条件提取大
5、豆中的异黄酮，定性研究大豆异黄酮的体外清除自由基能力，以及对亚硝胺合成的阻断作用和对亚硝酸盐的清除作用。 主要内容包括： 1.大豆异黄酮的提取 、纯化 2.不同浓度 大豆异黄酮 溶液 对 DPPH 自由基 的清除作用 3.不同浓度 大豆异黄酮 溶液 对活性氧自由基（ O2-）的清除作用 4.不同浓度 大豆异黄酮 溶液 对羟自由基（ OH）的清除作用 5.不同浓度 大豆异黄酮 溶液 对亚硝胺合成的阻断作用和对亚硝酸盐的清除作用 三、 拟采取的研究方法、研究手段及技术路线、实验方案等 本课题旨在利用实验室已经建立的 最佳条件对发芽大豆中的总黄酮进行提取 。 (1)大豆发芽前期准备：大豆除杂后清水冲
6、洗，用蒸馏水浸泡 12h、沥干，盖上纱布置于 25 、 85%湿度的常压恒温恒湿培养箱中进行萌发。以发芽大豆为原料，在 5560 下烘干后，粉碎，过 80 目筛，制得豆芽粉。 (2)利用 超声法辅助提取法 提取大豆异黄酮 ：称取一定量以上豆芽粉，于 45 水浴，用 70%的乙醇溶液浸提 2h， 1:20（ W/V）的料液比，浸提后用 60%的超声功率 (400W)，超声温度为 25 超声 40 分钟，抽滤得到初提取液，重复以上操作 3 次，合并滤液。旋蒸浓缩得到母液，用石油醚萃取脱脂数次，然后加入 1/5 体积的 savage 剂 (氯仿 :正丁醇=4:l)除蛋白，振荡混匀，离心取上清。经大孔
7、树脂分离纯化，得到较纯的大豆异黄酮提取液，用乙醇溶剂定容待测。以 染料木素为标准品，采用紫外分光光度法，测定大豆异2 黄酮得率。 (3)体 外自由基清除率测定： 结合实验室现有条件，采取 DPPH 体系法，氮蓝四唑(NBT)光化合还原法（邻苯三酚自氧化法）， Fenton 反应体系法，紫外分光光度测定 NO2-法 分别进行大豆异黄酮对 DPPH 清除率、超氧自由基 O2-的清除率和羟自由基 OH 的清除率、亚硝酸盐的清除率的测定，对其体外清除自由基能力进行分析研究。 1、 DPPH 体系法 DPPH（ 二苯代苦味酰自由基 ）在有机溶剂中是一种稳定的自由基，呈深紫色，在517nm有强吸收。有自由
8、基清除剂存在时， DPPH 的单电子被配对而使其颜色变浅，最大吸收波长处的吸光度变小 ，且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学计量关系的。因此，用该波长处的吸收可检测自由基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能力。抗氧化剂清除 DPPH 自由基的清除率越高其抗氧化性越强。 2、 氮蓝四唑 (NBT)光化合还原法及邻苯三酚自氧化法 (1)氮蓝四唑 (NBT)光化合还原法 甲硫氨酸作用于核黄素时可产生超氧离子自由基 O2-， O2-可还原氮蓝四唑（ NBT），使之转化为 CN4H4，而黄酮及活性多糖类化合物可以清除该反应，故可依据清除率高低来研究抗氧化剂对 O2-的清除效果。 (2)邻苯三酚自氧
9、化法 邻苯三 酚在碱性条件下迅速自氧化 , 自氧化过程中产生 O2-, O2-又加速邻苯三酚自氧化速率 , 同时产生有色中间物质 , 有色中间产物的积累在滞后 30 45 s 与时间成良好的线性关系 , 一般维持 4 min, 随后减慢。有色中间产物在 322 nm 有强烈的光吸收。由于自氧化的速率依赖于 O2-的浓度 , 消除 O2-则抑制自氧化反应 , 阻止中间产物的积累 , 从而评价受试物清除 O2-的能力。 3、 Fenton 反应体系法 Fenton 反 应 是 生 物 体 内 产 生 OH 的主要反应，其反应式可表示为：Fe2+H2O2Fe3+OH-+OH。用比色分析测定 Fent
10、on 反应体系产生的 OH，其中邻菲罗啉 -Fe2+是该反应中的一种常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。如果向反应加入 OH 的清除剂，则 OH 减少，同时 Fe2+增多，溶液颜色变红，由此可推算 OH 的清除剂对 OH 的清除效率。 4紫外分光光度测定 NO2-法 在大豆异黄酮试样 ,加入 5mLpH=3.0 的柠檬酸钠 -盐酸缓冲液 ,再加入 5g/ml 的3 NaNO2 溶液 1ml,用蒸馏水定容至 10ml,37 恒温 1h,然后各吸取 1ml 反应液于 7cm2 玻璃皿中 ,加入 1%对氨基苯磺酸溶液 1.5ml,摇匀，静止 2 3min，再加入 0.
11、1%萘胺 1.5ml,摇匀 ,加水至溶液体积精确为 5.0ml,放置 15min 后 ,用紫外分光光度计在 525nm 处测吸光度值。 计算清除率 :清除率 =(A0-Ax)/A0100% A0加入相应浸提剂空白实验的吸光度值； Ax加入不同浓度提取液时的吸光度值 。 四、中外文参考文献目录 1 文志胜 ,李里特 .大豆异黄酮及其生理功能研究进展 J.食 品工业科技 ,2000, (1) :78-80. 2 吴洪 ,陈雅婷 ,郑建福 ,马鹏 .柑橘不同部 位黄酮含量对亚硝酸盐的清除作用 N.泉州师范学院学报 ,2009-7(4) . 3 Zhongsheng Xu, Mengtian Tang
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