1、毕业论文开题报告 环境科学 筒孢藻毒素对鱼体免疫细胞的毒性研究 一、选题的背景和意义 1.选题背景 随着水体富营养化的加剧而引起的蓝藻水华频繁发生 ,已经引起全世界的普遍关注。水华爆发会影响和改变水的理化性质 ,降低水体的透明度和溶解氧 ,窒息浮游动物和鱼类 ,并产生难闻的气味 ,严重影响生物多样性、水体的景观和水的利用价值 ,更为严重的是许多水华藻类会产生毒素 ,杀死浮游动物、鱼类和野生动物 ,并通过食物链影响人类的健康。 蓝藻，呈蓝绿色，是地球上最早出现的光合自养型原核生物，没有细胞核和细胞壁、以内囊体形式存在于色素区 并以无性方式繁殖，通常是由单细胞或者多细胞组成的群体或丝状体。蓝藻毒素
2、是细胞内毒素 ,细胞破裂释放出来并表现毒性，主要由铜绿微囊藻、鱼腥藻、颤藻以及绿色微囊藻等产生。有关藻毒素的产生、构象、毒性分析等分析方法的研究已经成为学术界研究的热点，筒孢藻毒素更是蓝藻毒素的典型代表之一，相关问题亟待研究。 2.选题意义 鱼体是水生生态系统中较为低等的动物，极易受到水体污染的影响，产生多种生态效应，其中鱼体免疫系统是对污染胁迫应激的主要反应体系之一。筒孢藻毒素主要由藻华有毒蓝藻产生，并分泌在水体中，会影响鱼体免疫系统的健 康。因此，本研究以淋巴细胞为研究对象，开展筒孢藻毒素对鱼体淋巴细胞毒性的研究，明确产生效应的剂量效应关系，为藻华水体水质控制以及筒孢藻毒素新型蓝藻毒素的生
3、态毒理研究提供重要依据。 二、研究目标与主要内容 （含论文提纲） 1.研究目标 （ 1） 掌握鱼体淋巴细胞的分离与培养方法； （ 2） 掌握基于 MTT 测试的细胞毒性分析方法； （ 3）掌握细胞超微结构观察方法； 1 （ 4）掌握细胞凋亡典型电泳特征 DNA ladder 的测定方法 。 2.主要内容 （ 1） 筒孢藻毒素对鱼体淋巴细胞毒性剂量效应关系 ； （ 2） 筒孢 藻毒素对鱼体淋巴细胞超微结构的影响 ； （ 3） 筒孢藻毒素对鱼体淋巴细胞 DNA 损伤研究 。 三、拟采取的研究方法、研究手段及技术路线、实验方案等 3.1 材料与试剂 3.1.1 试验用鱼 试验用鲫鱼购自周边水产市场，
4、平均体长 20 cm，每尾平均体重 500 g，行动活泼、鱼鳍完整舒展，健康。实验室驯养 1 周后进行免疫毒理实验。 3.2 鱼体淋巴细胞的提取 3.2.1 免疫器官的提取 实验取鲫鱼体中肾脏和脾脏为主要受试组织。具体操作如下： 25ml烧杯装一定量的灭菌后的 PBS 待用，用酒精棉将鱼体消毒。从排泄口至胸 鳍，然后沿胸鳍及排泄口垂直剪至背部，将鱼肚沿剪切线向外翻，观察到内脏里有两条暗红色组织即脾脏。小心用弯头镊子取出至 PBS 中，而后在背部发现两块对称的有薄膜包背的组织，即肾脏，小心转移置 PBS 中，待后续实验使用。 3.2.2 淋巴细胞的提取 （ 1）用 PBS 漂洗至溶液基本透明，烧
5、去多余的血及组织碎片等。 （ 2）用手术剪将取出物剪碎，剪 5min 以上，剪成匀浆状。 （ 3）用 100 目不锈钢网筛过滤至小烧杯中 50ml，将 25ml 润洗后一并倒入至 64ml左右分离液。 （ 4）取 16 根无菌试管，分别加入 4ml淋巴细胞分离液， 然后沿试管壁小心慢慢加入 4ml细胞悬液，须保证溶液的上下分层。 （ 5）离心： 4000r min-1，离心 20min。 （ 6）小心仔细吸收交界处呈乳白状云雾层于新试管中，再次离心 5min，去除上清液，加入 1ml 含 10%新鲜胎牛血清的 RPMI1640 培养基中，取适量于 Nikon 显微镜下计数，细胞密度控制在 10
6、6cell mL-1， 27培养待用。 3.3 分析检测方法 1） 运用细胞活性 MTT 检测法，对毒素作用下淋巴细胞的存活率进行检测。 2 2） 运用透射电镜观察毒素作用下，鱼体淋巴细胞的凋亡情况 。 3） 运用琼脂糖凝胶电泳技术检测节球藻毒素对淋巴细胞 DNA 的损伤情况。 四、参考文献 1 Kiviranta J , Sivonen K, Niemela S I, et al. Detection of toxicity of cyanobacteria by Artemia salina bioassayJ. Environment Toxicology Water Qual1991,
7、 6:423-436. 2 Vasas G, Gaspar A, Pager C, et al. Analysis of cyanobacterial toxinsana toxinca, cylindrospermopsin, microcystin-LR by capillary electrophoresisJ. Electrp Horesis, 2004, 25(1):108-115. 3 Trogen GB, Annila A, Eriksson J, et al. Conformationalstudies of mirocystin-LR using NMR spectros c
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13、), 224-226. 五、研究的整体方案与工作进度安排 （内容、步骤、时间） 第一阶段（ 2010 年 11 月 10 日 -2010 年 11 月 20日 ）： 明确论文研究内容等基本问题 ； 第二阶段（ 2010 年 11 月 20 日 2010 年 11 月 30 日 ）： 熟悉实验室及相关仪器； 第三阶段（ 2011 年 12 月 1 日 2011 年 12 月 10 日 ）： 完成文献综述和外文翻译； 第四阶段（ 2011 年 12 月 10 日 2010 年 12 月 30 日 ）： 完成开题报告； 第五阶段（ 2011 年 1 月 1 日 2011 年 2 月 20 日 ）：
14、鱼体淋巴细胞体外分离提取实验； 第六阶段（ 2011 年 2 月 20 日 -2011 年 3 月 15 日）： 筒孢藻毒素细胞毒性和超微结构观察； 第七阶段（ 2011 年 3 月 15 日 -2011 年 3 月 30 日）：论文初稿撰写； 第八阶段（ 2011 年 4 月 1 日 -2011 年 4 月 30 日）：完成论文终稿等相关材料 六、研究的主要特点及创新点 （ 1） 筒孢藻毒素是继微囊藻毒素后新发现的肝毒性毒素，对筒孢藻毒素诱导鱼体免疫毒性机理研究有助于了解该毒素对鱼体的免疫毒性，为后续的科学研究提供理论依据。 （ 2） 试图从分子角度探讨筒孢藻毒素的毒性机理，研 究该毒素对鱼体免疫系统的基因损伤。
