1、毕业 论文文献综述 应用化学 大豆异黄酮提取及体外清除自由基研究 1前言 大豆是我国主要的粮食作物，营养丰富。古今中外的医学书籍中将大豆列为能使人类长寿的首要食品。明代著名医学家李时珍认为食服大豆令人长肌肤 ,益颜色、填骨髓 , 加气力 ,补虚能食、能宽中益气、和脾胃。近年来 ,西方膳食结构引起的肿瘤、心脑血管等疾病越来越受到关注。研究表明 ,膳食大豆异黄酮与癌症和冠心病的发病率密切相关 ,染料木素 (Genistein,G)和大豆甙元 (Daidzein,D)作为大豆异黄酮甙元主要成分 ,具有多种生理作用 ,应用价值很高 1。 2大豆异黄酮的成分及结构 大豆异黄酮是大豆中一类多酚化合物的总称
2、，是一类具有广泛营养学价值和健康保护作用的非固醇类物质。大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的次级代谢产物，主要分布在大豆种子的胚轴和子叶，胚轴中含量为 1% 2%，子叶含量为 0.1 % 0.3%2。自然界中大豆异黄酮的资源十分有限，仅存于豆科蝶形花亚科的极少数植物中，大豆是唯一在营养学上有意义的食物资源。 自 1931 年 Walz 首次从大豆中分离提取出大豆异黄酮 染料木素（ Genistein，又称金雀异黄素）以来，迄今已从大豆中分离出 9 种异黄酮葡 萄糖苷和 3 种相应的糖苷配基（即游离异黄酮）共 12 种大豆异黄酮。并根据紫外光谱、质谱、核磁共振谱分析确定出这些组分的结构（见图 1、
3、2 以及表 1、 2）。大豆异黄酮在自然界中的分布有限，其含量受多种因素的影响，如地理位置、生长季节、气候、培养条件和储存方式等。大豆中大豆异黄酮的含量仅为千分之几，而且 97% 98%以糖苷形式存在，苷元仅占 2% 3%。 O HR 2OR 3 OO H1 图 1 大豆中游离异黄酮结构式 O OHH OH O O HOO HC H 2 O R 1R 3R 2O图 2 大豆中含糖苷异黄酮结构式 表 1 大豆中 游离异黄酮的名称 3 英文名称 R1 R2 中文名称 Genistein OH H 染料木素 Daidzein H H 大豆甙元 Glycitein H OCH3 黄豆素甙元 表 2 大
4、豆中含糖苷异黄酮的名称 英文名称 R1 R2 R3 中文名称 Genistin OH H H 染料木甙 Daidzin H H H 大豆甙 Glycitin H OCH3 H 黄豆甙 6 - o - Acetylgenistin OH H COCH3 乙酰染料木甙 6 - o - Acetyldaidzin H H COCH3 乙酰大豆甙 6 - o - Acetylglycitin H 0CH3 COCH3 乙酰黄豆甙 6 - o - Malonylgenistin OH H COCH2COOH 丙二酰染料木甙 6 - o - Malonyldaidzin H H COCH2COOH 丙二酰
5、大豆甙 6 - o - Malonylglycitin H OCH3 COCH2COOH 丙二酰黄豆甙 3大豆异黄酮的提取和功能作用 近年来研究得出大豆异黄酮实验室最佳提取方案如下：称取大豆粉若干克，置于平底 烧瓶中，加入 100mL70%乙醇，于 45水浴，用 70%的乙醇溶液浸提 2h,1:20（ W/V）2 的料液比，浸提后用 60%的超声功率 (400W)，超声温度为 25超声 40 分钟，抽滤得到初提取液，重复以上操作 3 次，合并滤液。旋蒸浓缩得到母液，用石油醚萃取脱脂数次，然后加入 1/5 体积的 savage 剂 (氯仿 :正丁醇 =4:l)除蛋白，振荡混匀，离心取上清 4。经
6、 NKA 大孔树脂分离纯化，得到较纯的大豆异黄酮提取液，在 50下减压浓缩至粘稠状，移出后用 70%乙醇溶剂定容于容量瓶中。 3.1 抗癌作用 大豆异黄酮抗癌性的机理 ， Wattenberg 认为，它起到一种阻断剂的作用。因为所有的化学致癌物进入体内后，要在体内一种依赖于细胞色素 P450 的酶的作用下活化为可以与 DNA 反应或结合的中间物才有致癌活性。而大豆异黄酮作为“阻断剂”，可抑制该酶的活性，阻止化学致癌物活化为有致癌活性的中间物，或者诱导某些酶的活性，使致癌物脱毒，也可能与那些有致癌活性的中间物结合从而避免它们与 DNA 结合或反应。 而且，大豆异黄酮的抗癌活性由其激素样和非激素作
7、用引起。异黄酮的非激素作用体现在其抗氧化活性方面。关于其激素样作用，近年来的研究主要有以下几个 方面 5： 酪氨酸蛋白激酶（ PTK）的活性在细胞促有丝分裂信号传导过程中起重要作用，而染料木素为 PTK 强抑制剂，对 PTK 活性的抑制最终会影响细胞促有丝分裂的信号传导，从而抑制细胞的增殖，亦抑制癌细胞的生长。 染料木素可以促进 -生长因子的转录，从而抑制细胞周期和细胞生长过程。 异黄酮可以影响细胞凋亡过程中与抑制反应相关性表达有关的一个转录因子，进而影响细胞凋亡。 大豆异黄酮具有与雌激素相似的分子结构和分子量，与女性体内雌激素竞争结合雌激素受体，从而使体内雌激素水平保持平衡，降低与雌激素有关
8、的癌症的 发病危险。 3.2 抗氧化作用。 实验通过在大豆油、棉籽油和葵花籽油中添加大豆异黄酮 , 发现大豆异黄酮是一种优良的天然抗氧化剂 , 其抗氧化能力强于 TBHQ。且大豆异黄酮的抗氧化性随其添加量的不同而不同 , 对于大豆油来说 , 其添加量对其影响不大 , 而对于葵花籽油和棉籽油的影响较大 , 且抗氧化作用随着添加量的增加而增加 , 大豆异黄酮较理想的添加量是200mg/kg。而且大豆异黄酮对猪油油脂的自动氧化具有很好的抑制作用 , 同浓度的游离型大豆异黄酮的抑制作用比糖苷型强。作为抗氧化剂的黄酮类化合物可以添加到奶酪、水果和 蔬菜、坚果、土豆粉和土豆片、饮料、风味物质、糖果制品、猪
9、油、植物油中去 ,3 防止这些食品脂质氧化腐烂变质，而起到保鲜作用。 3.3 预防骨质疏松症 实验表明 , 染料木黄酮可抑制骨骼再吸收。在异黄酮与骨质疏松的关系方面 , 目前主要集中在以去卵巢大鼠为模型的动物实验上 , 大量研究表明异黄酮具有减少骨质丢失 , 促进骨生成的作用 6。于向东等应用雌性大鼠去势方法复制绝经后骨质疏松症模型，是目前首选的方法 , 并观察到模型动物雌激素下降 , 骨吸收与骨形成的偶联出现缺陷等。去势大鼠骨密度及骨组织在大豆异黄酮作用下，骨小梁排列 整齐 , 连接成网 , 面积、密度无明显减少 , 骨密度增加 , 减少去势大鼠骨小梁和骨皮质丢失。因此可以证明大豆异黄酮对卵
10、巢切除大鼠骨质疏松症有明显防治作用。 3.4 缓解更年期综合症 更年期综合症是由于妇女绝经后卵巢分泌的雌激素减少而造成的。据统计 , 日本更年期妇女出现潮热的不到 20%, 而美国妇女潮热的发生率却高达 85%。目前认为这与食物中大豆蛋白占比例较大有关 , 日本妇女每天大约摄入 200mg 的植物雌激素 , 主要是来自豆类制品。大豆异黄酮具有雌激素活性 , 因此食用大豆食品可弥补因绝经减少的雌激素 , 从而减轻或 避免引起更年期综合症。研究表明 , 绝经期妇女服用大豆异黄酮 , 年龄较大者 , 加大药物剂量 , 血中的激素也有相应的变化 , 促卵泡生成素（ FSH）、促黄体生成素（ LH）明显
11、降低 , 泌乳素（ PRL）、雌二醇（ E2）升高 ,对绝经期潮热面红、自汗盗汗、心烦不宁、失眠多梦、头晕耳鸣临床症状都有改善 , 这表明绝经期妇女服用大豆异黄酮 , 血中激素水平到达一定数量 ,能改善更年期妇女性激素和临床症状 7。 3.5 预防心血管疾病 对于大豆异黄酮在预防心血管疾病过程中的作用机制尚未完全阐释清楚，目前主要有以下几点认识 8： 调节低密度脂蛋白（ LDL）受体：大豆异黄酮可以增强 LDL 受体的活性，从而促进胆固醇的清除。 抗氧化特性：大豆异黄酮对脂质过氧化体系中的脂质自由基有显著的清除作用，可有效地抑制氧化级联反应。染料木素可以有效地抑制脂粒氧化。 抗血栓形成：酪氨酸
12、蛋白磷酸化与血小板活性密切相关，染料木素通过对酪氨酸激酶的抑制作用来阻断血小板源性生长因子的生成，进而导致血小板活性降低，抑制其在血管上聚集，阻止粥样硬化的发生。 舒血管作用：雌激素对在体和离体血管都有舒张作用，染料木素在舒张血管的同4 时还可以增强其它血管舒张剂的舒血 管效应，从而使组织血流量进一步增加。 抑制血管平滑肌细胞的增殖：血管平滑肌细胞的过度增殖是粥样硬化发生的重要环节，染料木素可以降低成纤维细胞生长因子（ FGF）和纤维蛋白溶酶源激活因子的活性，从而抑制平滑肌细胞增殖。 3.6 降低血糖作用 大豆异黄酮是一类天然降血糖成分 , 其作用机制主要有保持细胞活性 , 抑制胰岛俘细胞凋亡
13、干扰小肠对糖的吸收 , 使餐后血糖峰值后移与降低胰岛素样作用 , 促进外周组织利用糖 , 调整糖代谢通过抗氧化、维护生物膜稳定 , 保护胰组织 , 调节与糖代谢有关的酶类的释放及其活性。大豆异黄酮对糖 尿病进行干预时 , 可抑制小肠对糖的吸收 , 更好地调整体内糖代谢平衡染料木黄酮、大豆苷原与大豆苷原的细菌代谢产物雌马酚 , 在体外能预防人的由糖诱导的低密度脂蛋白脂质过氧化反应。大豆异黄酮在体外能抑制兔小肠粘膜对糖的吸收。另外 , 大豆异黄酮具有较弱的雌激素样作用 , 对糖尿病患者的代谢紊乱也有一定的调节功能，具有降血糖作用 9。 3.7 抗衰老作用 随着年龄的增加 , 人体内抗氧化酶下降 ,
14、 自由基积累过多 , 与脂肪酸形成过氧化物 , 引起细胞膜损伤 , 导致疾病和衰老。降低机体内氧化水平或增强内抗氧化水平 , 对抑制氧化 的 LDL 的形成 , 降低 AS 的危害和抗衰老是十分必要的。由此可见 , 人体衰老是活性自由基造成的。黄酮类化合物不但能吸收活性自由基 , 还能将起催化氧化的金属离子络合 , 从而起到抗衰老的作用。酱油中的大豆苷、染料木苷能抑制体内的过氧化反应 , 防止老化。利用大豆异黄酮原粉对小鼠衰老实验表明 , 大豆异黄酮可显著降低衰老小鼠全血过氧化脂质含量 , 提高谷胱甘肽化物酶活性 , 并显著提高皮肤羟脯氨酸含量。显示大豆异黄酮具有一定的抗衰老作用 10。 4体
15、外清除自由基实验研究进展 目前 大豆异黄酮在体外对自由基的清除能力 研究的主 要 方法有 DPPH 法、 Fenton 反应体系法、 氮蓝四唑 (NBT)光化合还原法、邻苯三酚自氧化法、抗坏血酸 Cu2+-H2O2 体系法等 11。实验 数据证明大豆能起到一定的抗衰老的作用以及其他的保健功效。 以便生产出具有治疗特异性高、高效、低毒的药品和天然保健品，同时有利于探索发现研究先进的提取分离方法，加速植物资源的有效开发利用。 以下简单例举了比较成熟的大豆异黄酮体外清除自由基的几个方法： 4.1、 DPPH 体系法 5 DPPH（ 二苯代苦味酰自由基 ）在有机溶剂中是一种稳定的自由基，呈深紫色，在5
16、17nm有强吸收。有自由 基清除剂存在时， DPPH 的单电子被配对而使其颜色变浅，最大吸收波长处的吸光度变小，且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学计量关系的。因此，用该波长处的吸收可检测自由基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能力。抗氧化剂清除 DPPH 自由基的清除率越高其抗氧化性越强。 4.2、 氮蓝四唑 (NBT)光化合还原法及邻苯三酚自氧化法 4.2.1 氮蓝四唑 (NBT)光化合还原法 甲硫氨酸作用于核黄素时可产生超氧离子自由基 O2-， O2-可还原氮蓝四唑（ NBT），使之转化为 CN4H4，而黄酮及活性多糖类化合物可以清除该反应 ，故可依据清除率高低来研究抗氧化剂对 O
17、2-的清除效果。 4.2.2 邻苯三酚自氧化法 邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化 , 自氧化过程中产生 O2-, O2-又加速邻苯三酚自氧化速率 , 同时产生有色中间物质 , 有色中间产物的积累在滞后 30 45 s 与时间成良好的线性关系 , 一般维持 4 min, 随后减慢。有色中间产物在 322 nm 有强烈的光吸收。由于自氧化的速率依赖于 O2-的浓度 , 消除 O2-则抑制自氧化反应 , 阻止中间产物的积累 , 从而评价受试物清除 O2-的能力。 4.2.3Fenton 反应体系法 Fenton 反 应 是 生 物 体 内 产 生 OH 的主要反应，其反应式可表示为：Fe2+H2O2
18、Fe3+OH-+OH。用比色分析测定 Fenton 反应体系产生的 OH，其中邻菲罗啉 -Fe2+是该反应中的一种常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。如果向反应加入 OH 的清除剂，则 OH 减少，同时 Fe2+增多，溶液颜色变红，由此可推算 OH 的清除剂对 OH 的清除效率。 4.2.4 紫外分光光度测定 NO2-法 在大豆异黄酮试样 ,加入 5mLpH=3.0 的柠檬酸钠 -盐酸缓冲液 ,再加入 5g/ml 的NaNO2 溶液 1ml,用蒸馏水定容至 10ml,37 恒温 1h,然后各吸取 1ml 反应液于 7cm2 玻璃皿中 ,加入 1%对氨基苯磺酸溶液
19、 1.5ml,摇匀，静止 2 3min，再加入 0.1%萘胺 1.5ml,摇匀 ,加水至溶液体积精确为 5.0ml,放置 15min 后 ,用紫外分光光度计在 525nm 处测吸光度值。 计算清除率 :清除率 =(A0-Ax)/A0100% A0 加入相应浸提剂空白实验的吸光度值； 6 Ax 加入不同浓度提取液时的吸光度值 12。 5发展趋势和展望 随着人类生活水平的提高 , 人们越来越重视身体的保健。 大豆异黄酮具有多种药理特性及多方面的保健功能，对人体多种疾病均有一定的疗效，它不仅是广效药物而且是天然保健品，为其开发利用展示了广阔前景。随着人类文化素质的提高和人们饮食观念的变化 , 富含大
20、豆异黄酮的大豆制品和添加有大豆异黄酮的各类食品将会越来越受到更多人的青睐。 目前大豆异黄酮已经广泛被提取并商业化，成为受人们喜欢的保健品之一，但是对大豆异黄酮的体外清除自由基方面的研究报道甚少，因此本论文将立足与此，提取纯化大豆异黄酮后，在模拟体外条件下，研究大豆异黄酮对自由基的清除能力，以求更一步证明大豆异黄酮的保健功 效。 参考文献 1Walz E.Isoflavones and saponing-glucoside in SoyaJ.Hispida Justus Liebigs Ann Chem,1931,498:115-118. 2陈学兵 ,罗莉 .大豆异黄酮的抗癌作用 J.食品研究与
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