1、毕业 论文文献综述 应用化学 高效液相色谱的发展及现状 1. 色谱技术的发展历程 色谱技术的研究起步于 20 世纪初，俄国植物学家 M.S.Tswett 发表了题为“一种新型吸附现象在生化分析上的应用”的研究论文中提到了一种用吸附原理分离植物的方法，并将其命名为色谱法。但由于这种色谱分离技术速度慢且效率低，没有受到科学界重视。 1938 年获得诺贝尔化学奖的德国化学家 Kuhn 采用 Tswett 色谱分离技术，在维生素和胡萝卜素的分离和结构的分析中取得了重大成果，色谱法因此得到各国科学家的关注 1。可以预想到，在接下来的几十 年中，色谱技术更是飞速发展。随着 1940 年 Martin和 S
2、ynge 提出液液分配色谱法后， 1952 年 James 和 Martin 发明了气相色谱因此获得 1952年诺贝尔化学奖 2。紧接着，通过各国科学家的努力，还分别开创了毛细管气相色谱法、毛细管超临界色谱、毛细管电泳和电色谱等分析分离技术，使色谱技术的应用日益广泛。 高效液相色谱出现于 20 世纪 60 年代末，由高压泵和键合固定相应用于液相色谱，导致了高效液相色谱的出现。直至今日，高效液相色谱技术不断发展，并广泛应用在各个领域，成为分析、分离技术中不可或缺的一种尖端科 技。 2.高效液相色谱的构成 高效液相色谱是近几十年来分析化学中最活跃的领域之一。这种将分离手段及检测系统相连接的分析分离
3、技术，逐步成为在生化药物、精细化工产品、环境保护等各个领域中主要的物质分析分离方法 3。 2.1输液系统 泵 由于色谱柱很细，填充剂粒度小，因此阻力很大，为达到快速、高效 的 分离 效果 ，必须 要提高 柱前压力，以获得高速的液流 ，使分析、分离更加有效率的进行。泵为液相提供了流动相流动所必须的压力。 2.2进样系统 一般高效液相色谱 对于 进样系统多采用六通阀进样 4。先由注射器将样品常压下注入样品环 5。然后 切换阀门到进样位置，由高压泵输送的流动相将样品送人色谱柱。样1 品环的容积是固定的，因此进样重复性好。 2.3分离系统 色谱柱 色谱柱是高效液相色谱技术中最关键的一个组成部分，起着至
4、关重要的作用 6。它作用于样品中各种不同组分，使这些组分按顺序进入检测器中，从而起到分析分离的作用。色谱柱按操作方式和目的来分，可分为用于分析样品性质、结构等特性的分析型色谱柱和用于分离、提纯样品，提高样品质量的制备型色谱柱 7。而按分离模式来分，可以主要分为正相吸附色谱和反相分配色谱。其中，正相吸附色 谱一般以己烷、庚烷做为非极性流动相，色谱柱中的固定相为极性，从而吸附各种物质，使非极性物质先进入检测器出峰；而反相分配色谱一般以甲醇、乙醇、乙腈或二氯乙烷等做为极性流动相，色谱柱中的固定相为非极性物质，使极性物质先出峰。一般日常使用中，使用反相色谱的概率约为八成，本次实验也使用反相分配色谱柱。
5、 色谱柱另外一个重要的影响因素为色谱柱中的填充物。在日常使用中，一般以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等集团联在基质上做为固定相，其具有固定相稳定，不易流失；应用广泛，可使用多种溶剂；消除硅羟基的不良影 响等特点。 2.4检测系统 高效液相色谱检测器是关键部件之一。它的作用主要是把经过色谱柱的流动相中的样品组分的量转变为电信号，并在计算机上输出，产生谱图。检测器一般要符合灵敏度高、对外界变化不敏感、线性范围宽、重复性好、适应范围广等特点。按原理可分为光学检测器、热学检测器、电化学检测器等，其中最常用的为紫外 -可见光检测器，以及针对在紫外区有有吸收的化合物所使用的二极管阵列检测
6、器。本次实验所检测的物质在紫外光中有吸收，因此，使用的为紫外 -可见光检测器。 2.5 输出系统 将一台计算机与高效液相色谱 仪器相连接，并安装所需软件，可对液相装置进行调试以及相关条件的改变。 7在检测系统将样品组分的量转变为电信号后，在计算机上输出，并产生谱图，用来处理实验数据和反控仪器运行。 3.高效液相色谱的原理 它的原理是在被流动相液体带入色谱柱中时，利用复杂混合物在固定相和流动相中不同的分配系数、吸附能力等因素，使各组分彼此分离，从而达到分离的目的 8。高效液相色谱按操作方式和目的来分，可分为分析型和制备型两种。为了了解样品性质、结构、组成等信息的为分析型；而制备型则是为了获得目标
7、组分。所以，可以说分析型为2 分析工具，而 制备型为分离技术 9。由于分析型和制备型需要的操作条件明显不同，因此前者进样量越小越好，且要避免色谱柱的超载问题；后者则要提高产量，色谱柱的超载是必须的。 4.高效液相色谱的特性 这种分离技术具有操作条件温和、选择性高、批处理量较大和操作自动化等优点，可以将物化差别很小的复杂化合物分离，使之成为分析分离各种物质最有效的方法之一10-11。液相色谱法对要进行分离的样品要求较低，不受样品挥发度和稳定性的限制，且非常适合含有离子型化合物、不稳定的天然产物等大分子的生物药品，使之在广泛的领域发挥作用。因 此，高效液相色谱法仍是从事研究工作和工业生产实际应用比
8、较普遍的色谱法。 5.实验操作 5.1 前处理 取含有 0.2%2 -甲基化杂质的粉末状固体 20g，加入 200ml 甲醇，配成母液备用。将母液装入圆底烧瓶中，搭建回流装置并进行加热回流，以促使原料物充分溶解。待溶解后母液冷却析晶时对母液进行过滤。收集滤液，并将滤液重复上述过程三次，从而使目标分离物在晶体中含量提高到 1%左右。 5.2 液相色谱的分析 将得到的 1%的目标杂质，加入少量色谱甲醇进行溶解，准备进行分析。选用 ultra pack ods-sm-50c 型号的 硅胶柱 (37*300mm)，并按要求在硅胶分析柱填充石油醚和乙酸乙酯 (65:35)，装柱后，以色谱纯甲醇和哇哈哈纯
9、净水作为流动相，用高压恒流泵（ FL2200，浙江福立分析仪器有限公司）将流动相打入分析柱，以保证其流量为10ml/min，对目标分离物进行分析 。 6.结论 从液相色谱的出现，到高效液相色谱的普及和发展，无论在色谱基础理论、新的流动相的使用、色谱柱的精细程度和仪器的研制和改进，还是高效液相色谱实际应用方面都有了很大程度上的提高。可以想象，随着不断的进步，液相色谱将在更多的领域里发挥出必 不可少的作用，并和其他技术联用，向着高精度、高灵敏度、高效率、更加自动化的方向发展。 3 参考文献 1. 王志祥 ， 莫芬珠，余国琼，制备型液相色谱分离技术进展 J，化工时刊， 1997,11（ 5）：12-
10、17. 2. 王志祥，何志敏，余国琮，制备型高效液相色谱中的质量超载 J，高校化学工程学报，1997, 11 (1)： 83-87. 3. 傅若农 ， 顾峻岭 ， 近代色谱分析 M， 第一版 ， 北京 ： 国防工业出版社 ， 1998, 199-200. 4. 李瑞萍 ， 黄骏雄 ， 高效制备液相色谱柱技术的研究进展 J，化学进展 ， 2004,16（ 2）：273-282. 5. 李军 ， 徐本明 ， 刘珂 ， 曲克芦丁对照品的制备液相色谱法分离 J.中国医药工业杂志， 2004, 35: 285-287 . 6. 陈晓辉 ， 谭晓杰 ， 田中克佳 ， 制备型高效液相色谱在中药野菊花化学成分
11、分离中的应用J.药品评价 ， 2004, 1(5):359-361. 7. 彭密军 ， 周春山 ， 董朝青， 等 ，制备液相色谱 台阶梯度法分离纯化杜仲中三种环烯醚萜化和物 J .色谱， 2004, 22 (2):184-186. 8. 魏莉 ， 张焜 ， 方岩雄 ， 等 ， 制备型高效液相色谱技术的研究进展 J， 广东化工 ， 2005,11：5-7. 9. Stefano Provera, Luca Rovatti, Lucilla Turco， etcl， A multi-technique approach using LCNMR, LCMS, semi-preparative HPL
12、C,HRNMR and HRMS for the isolation and characterization of low-level unknown impurities in GW876008, a novel corticotropin-release factor 1 antagonistJ， Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2010,53： 517-525. 10. Jose Luiz Mazzei， Luiz Antonio dAvila， Chromatographic models as tools for scale-up of isolation of natural products by semi-preparative HPLCJ,liquid chromatography&related technologies ， 2003， 26(2):177-193.
