1、宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析I本科毕业设计环境工程宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析THEINVESTIGATIONANDANALYSISABOUTTYPICALEDCSPOLLUTIONOFBREEDINGWATERSINNINGBOCITY宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析II摘要【摘要】为了研究宁波市养殖水域典型环境激素污染现状，主要是研究壬基酚对环境的污染，采用液相色谱的方法对养殖水域中采集的水样进行壬基酚的测定，水样中壬基酚的萃取采用固相萃取法。先用壬基酚标准使用液采用液相色谱法进行标准曲线的绘制，然后对从水样中萃取出来的壬基酚进行测定，来以此分析养殖水
2、域典型环境激素壬基酚的污染现状。通过实验发现，宁波市某些养殖水域壬基酚的浓度较高，最高达10UG/L，这说明宁波市养殖水域已经造成了壬基酚的污染。【关键词】环境激素；壬基酚；液相色谱法；固相萃取宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析IIITHEINVESTIGATIONANDANALYSISABOUTTYPICALEDCSPOLLUTIONOFBREEDINGWATERSINNINGBOCITYABSTRACT【ABSTRACT】INORDERTOINVESTIGATIONANDANALYSISTHEPOLLUTIONOFBREEDINGWATERSTYPICALENVIRONMENTAL
3、HORMONEINNINGBOCITYESPECIALLYTOSTUDYTHEPOLLUTIONOFNONYLPHENOLTORHEENVIRONMENTLIQUIDCHROMATOGRAPHYMETHODISUSEDTODETERMINATIONTHENONYLPHENOLOFWATERSAMPLESINBREEDINGWATERSEXTRACTIONOFNONYLPHENOLINWATERSAMPLESBYSOLIDPHASEEXTRACTIONFIRSTUSELIQUIDCHROMATOGRAPHYTODRAWASTANDARDCURVEOFNONYLPHENOLSTANDARDUSES
4、LIQUIDTHENEXTRACTEDNONYLPHENOLFROMWATERSAMPLESWEREDETERMINEDTOANALYSISTHETYPICALENVIRONMENTALHORMONEPOLLUTIONABOUTNONYLPHENOLINBREEDINGWATERSTHROUGHEXPERIMENTSWEFIND,THENONYLPHENOLSOFBREEDINGWATERSINNINGBOCITYISHIGHCONCENTRATIONS,TOPPED10UG/L,THISSHOWSTHEBREEDINGWATERSINNINGBOCITYHAVECAUSEDNONYLPHEN
5、OLSPOLLUTION【KEYWORDS】ENVIRONMENTALHORMONESNONYLPHENOLLIQUIDCHROMATOGRAPHYSOLIDPHASEEXTRACTION宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析IV目录1引言12环境激素污染及研究概述221环境激素污染的现状及危害2211环境激素概述2212酚类环境激素污染及危害322环境介质中痕量壬基酚检测技术5221样品前处理方法5222环境样品中壬基酚的检测分析方法63样品的采集与实验方法931采样点的布置及样品采集9311采样点的布置9312样品的采集及保存1032实验方法10321仪器和试剂10322样品预处理11
6、323高效液相色谱仪实验操作12324HPLC条件的优化134结果与分析1541HPLC条件的优化结果15411流动相的比选结果15412乙腈/水为流动相HPLC分析条件的优化1642方法回收率、检出限及线性范围18421方法回收率18422检出限21423线性范围2243宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查结果及分析23431宁波市养殖水域壬基酚污染调查结果23432与国内外其它环境介质中壬基酚污染状况的比较2444结论2445展望25参考文献26附录28宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析11引言环境激素是由人类的生产和生活活动而释放到周围环境中的，作为目前的一种被公众所开始关注的
7、污染物质，已成为了研究的热点。随着我国经济的发展，工业化的提高，环境激素在环境中的污染越来越严重。其中，环境激素中的一种物质壬基酚，作为一种具有雌激素活性的污染物质，具有极大的毒性及难降解性，可以发现，这类物质最终排入水体，对生态环境的影响不容忽视。目前，对该领域已有些研究，我国重庆流域嘉陵江和长江及海河水体中检测到了NP污染。但是，在对养殖水域的典型环境激素还鲜有研究，宁波是一座沿海城市，养殖水域比较多，加上工业较发达，必然会产生环境激素类物质的污染，所以对宁波市养殖水域典型环境激素的亟需调查研究。宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析2环境激素污染及研究概述21环境激素污染的现状及危害
8、211环境激素概述从20世纪末到本世纪初，一类长期存在却一直不为公众所关注的污染物质内分泌干扰物ENDOCRINEDISRUPTINGCHEMICALS，即EDCS，渐渐浮出水面，成为当前环境科学研究领域中的热点问题。EDCS,又称环境激素，环境激素对内分泌的干扰作用主要表现为对雌激素、雄激素以及甲状腺代谢的影响，其中雌激素样作用是最主要的1。环境内分泌干扰物ENVIRONMENTALENDOCRINEDISRUPTINGCHEMICALS,EDCS是指可通过干扰生物或人体内保持自身平衡和调节发育过程天然激素的合成、分泌、运输、结合、反应和代谢等，从而对生物或人体的生殖、神经和免疫系统等的功能
9、产生影响的外源性化学物质。它们主要是通过人类的生产和生活活动排放到环境中的有机污染物。环境内分泌干扰物被列为继臭氧层空洞和地球变暖之后的又一新的环境污染问题，成为当前国际上研究的热点。1996年，COLBORN等人出版了OURSTOLENFUTURE一书，书中对人工合成化学品在环境和食品中的残留、积累以及对人类内分泌、免疫系统等的干扰提出了警告，在国际上得到广泛认识和关注，随后各发达国以巨大的投入开展环境激素污染研究。1996年，美国环境保护署USEPA开始着手建立并开发食品、饮料中的环境激素物质的筛选方法；同年8月，欧洲经济协力开发机构（DECD）也开始了环境激素的实验方法的开发；英国环境署
10、对环境激素类物质的生产和排放也加以控制，并将其确认为优先研究领域。美国环保局于1997年列出影响动物及人类内分泌系统的物质名单共75种，日本环境厅于1998年在关于环境内分泌干扰物的战略计划98中对具内分泌干扰效应物质进行筛选并列出内分泌干扰物名单。被报告具有生殖和内分泌干扰作用的化学物质主要包括持久性有机污染物、农药类、邻苯二甲酸酯类、其它化合物及部分重金属。通过对环境中各类物质的鉴别和筛选，在全球约1000万种化学物质（包括大量的合成化学品）中，已有70种显示雌激素活性，并被确认为环境激素类物质，包括镉（CD）、铅（PH、汞（HG）3种重金属和67种有机物，主要分属于烷基酚、烷基酚聚氧乙烯
11、醚（APES）、双酚A，邻苯二甲酸盐（或酯）（PAE）、多氯联苯类、农药、类固醇等，其中化学农药类达44种。常见的环境激素包括有机锡、二乙基人造雌性激素、多溴联苯醚PBDES、六溴环十二烷HEXABROMOCYCLODODECANE，HBCD、二恶英DIOXIN、双酚A（BISPHENOLA）与其衍生物、多氯联苯（POLYCHLORINATEDBIPHENYLS，PCB、METHOMYL、烷基酚聚氧乙烯醚（APE）、壬基酚NONYLPHENOL，NP等。我国在环境激素类污染物的调查分析方面起步较晚，但对有毒有机化合物业已进行了大量的卓有宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析3成效调查研究工
12、作。对我国水环境中的内分泌干扰化学物质污染调查的初步结果表明，在所调查的各种海域和内陆江河、饮用水及食物中都存在多种环境激素类污染物质，我国进一步开展环境激素污染研究势在必行。目前国内外对环境激素物质的研究主要集中在以下几方面环境激素物质快速筛选的方法。目前使用的方法涉及细胞水平、受体水平和分子水平等各层次进行研究，包括整体生物实验法和体外生物实验法。环境激素对生物与人体的危害及其机理。有关环境激素对野生生物造成危害的报道以水生生物居多，主要表现为生殖器官、生殖机能和生殖行为异常。环境激素对人体的影响，多采用流行病学、免疫学等研究手段。环境激素的致毒机理。目前，有关环境激素对生物和人体的毒理影
13、响，主要着重于个体水平上的研究，有关环境激素对生物和人体造成影响的阈值研究也尚未开展。环境激素的表生行为及其环境效应。主要分析研究环境激素的环境水平、表生行为和环境效应，包括在环境中的源、汇、迁移转化机制，及进入人体的关键途径。环境激素对人体的危害主要是通过含有这种激素成分的物质，被人食用或使用后产生的不良反应。比如化妆品、洗浴剂、洗洁剂、瓜果、蔬菜、肉类、食品等，当环境激素进入人体时，会让人体内的内分泌系统误认为是天然荷尔蒙，而加以吸收，占据了在人体细胞中正常荷尔蒙的位置，从而引发内分泌紊乱，造成人体正常激素调节失常。表现在发育障碍、生殖异常、器官病变、畸胎率增加、母乳减少、男性精子数下降、
14、精神、情绪等多个方面的问题。不仅是人体，对于其它野生动物体也是一样的。同时，多数环境激素也属于“持久性有机污染物”POPS），在环境中十分稳定而难以分解，因此可存在甚长的时间，不易清除。持久性有机污染物由于具有毒性、难降解与生物累积性，加上可怕的蚱蜢跳效应（又称为蚱蜢效应，GRASSHOPPEREFFECT）增强其传递性。部分污染物质在气温高时易挥发进入大气，经由风吹而移入低温区，然后凝集或藉由降雨返回地表，当气温再度升高时，污染物又会进入大气当中，如此周而复始反复在大气中蒸发、迁移与沈降，藉由空气、水和吸附物的携带，可传递至远离污染源排放的地点污染其它干净的区域，因而生态系统也发生了破坏。应
15、该说，那些被归类于环境激素的化学物质有很多确实给人类带来了明显的经济利益，但是却潜伏下了一些危害。对人体健康和生态系统造成了一定程度的危害，如果不加以进行研究，将对人体健康和生态系统造成严重的影响。很有必要对其进行研究。212酚类环境激素污染及危害1酚类环境激素总体情况在所发现的环境内分泌干扰物中，壬基酚、辛基酚、双酚A其相似的结构特征和类雌激素活性逐宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析渐被划分为一类新的研究对象，称为酚类环境雌激素。这些酚类环境激素能够引起鱼类和螺类等生物的性别反转，同时这些污染物还具有致癌性、致畸性和致突变性，因此引起了人们的广泛关注。这些酚类化合物均属于环境雌激素，
16、尤其是双酚A和辛基酚的雌激素效应更大，辛基酚是雌激素活性最强的烷基酚类物质的降解物，可导致雄性动物血清性激素水平下降和精子数量减少，以及雌性动情期延长。双酚A属低毒性化学物。动物试验发现双酚A有模拟雌激素的效果，即使很低的剂量也能使动物产生雌性早熟、精子数下降、前列腺增长等作用。此外，有资料显示双酚A具有一定的胚胎毒性和致畸性，可明显增加动物卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌症的发生。对于壬基酚同样具有内分泌干扰效应，此次将主要对壬基酚进行研究。（2）壬基酚的排放源和环境危害壬基酚是一种重要的精细化工原料和中间体，外观在常温下为无色或淡黄色液体，略带苯酚气味，不溶于水，溶于丙酮。主要用于生产表面活性
17、剂、也用于抗氧剂、纺织印染助剂、润滑油添加剂、农药乳化剂、树脂改性剂、树脂及橡胶稳定剂等领域。我国壬基酚主要用于生产非离子表面活性剂和改性酚醛树脂，少量用来生产阴离子表面活性剂及其他产品。壬基酚为粘性的无色液体，比重0937，难溶于水。壬基酚化学性质比较稳定，但能被强氧化剂氧化。由于难溶于水、稳定性及较强的生物累积性，将会限制地球环境中的NP的滤去。壬基酚作为内分泌干扰物对人体癌细胞增长均会产生比较严重的影响。研究表明，10UMOL/L的4NP导致人体MCFF乳腺癌细胞增生的能力与30PMOL有17雌二醇相当2。壬基酚被证实是环境激素中毒性最大、最难被生物降解的污染物，对环境的污染比较严重。经
18、研究发现，对位取代产物4壬基酚或4NONYLNHENOL，简称壬基酚具有雌激素活性3。壬基酚作为洗涤剂的降解产物，是烷基酚的典型代表4。这类物质最终排入水体，对生态环境的影响不容忽视。（3）壬基酚在各环境介质中的污染水平目前，世界壬基酚的总产量约35万吨每年，且在使用后大部分进入各种水体环境。我国壬基酚的产量为21000吨/年，被广泛的用于合成非离子表面活性剂和抗氧剂。STAPLES5和BANAT6等研究证明，壬基酚在环境中性质稳定，不易降解，从而科学地解释了环境中壬基酚含量不断增加的现象。壬基酚广泛存在于城市污水处理厂污泥、河流、饮用水及生物体内。KUCH在饮用水中检测到壬基酚的浓度为054
19、0NG/L。AHEL等在GLATT流域淡水植物体内检测到NP的质量浓度在2538NG/G，鱼体内的质量浓度在00316NG/G。我国重庆流域嘉陵江和长江及海河水体中也检测到NP污染。雷炳莉等对温榆河上游及干流的主要排污口、重点闸坝、主要入河口等河段表层沉积物中的壬基酚进行了调查研究，在样品中普遍检出NPS，浓度范围为12581579NG/G。壬基酚分子结构与人体内雌二醇的分子结构相似，由环境进入生物体内以后，主要通过模拟内源性雌激素作用机制，影响生物机体内分泌系宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析5统功能。环境中微量浓度的壬基酚可导致鸟类和爬虫动物的性别比例异常，鱼和蟾蜍的异性化，诱导雌
20、鼠子宫的早期发育。鉴于壬基酚污染物的生殖毒性，美国国家环保局EPA的推荐标准为，在淡水中，壬基酚的含量不应高于66UG/L，在咸水中不应高于17UG/L。在国内，在对中国环境内分泌干扰物的污染现状分析中，可以发现壬基酚的污染比较严重。主要海域、江河湖泊均可检测到壬基酚。表21部分地区水体中壬基酚污染现状污染区域壬基酚污染现状参考文献西瓦胡壬基酚质量浓度为1741134NG/L7嘉陵江和长江重庆段河流壬基酚质量浓度为069UG/L8珠江三角洲珠江壬基酚一般低于400NG/L,某些水域浓度较高，达1650NG/L伶仃洋及近海表层水壬基酚浓度较低，低于140NG/L。9通过对不同发达国家及地区的ST
21、PS出水及地表水的检测，都能检测到NP的存在。（表2已列出）从各国NP类物质存在水平比较中发现，各国NP含量有一定差别。表22NP的质量浓度/UG/L地点采样数量STPS出水中质量浓度采样数量地表水中质量浓度参考文献英国160254390035310西班牙363436LOD64411澳大利亚45022334612中国114813台湾地区1070895014荷兰2091522环境介质中痕量壬基酚检测技术221样品前处理方法（1）环境样品的前处理方法研究进展概述宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析对于环境水样、沉积物样品及动物组织样品，目前常用的前处理方法有蒸汽蒸馏、液液萃取、离心萃取、固相
22、萃取SPE及固相微萃取等技术。GIGER等利用水蒸汽蒸馏浓缩水废水中的壬基酚。STEPHANOUE等以二氯甲烷为萃取剂运用非连续萃取的方法测定了污水处理厂出水中的壬基酚，对待测样品有很好的回收率。PAWLISZYN等将固相微萃取技术与HPLC有机结合起来开发了酚类化合物在线SPMEHPLC分析方法。邵兵等将压力加速溶剂萃取技术应用于动物组织中壬基酚的含量测定，并对各种萃取参数和净化条件进行了详细研究。KANNAN等利用蒸汽蒸馏技术建立了鱼肉组织中壬基酚的提取方法。UGUZ等建立了鱼肝脏中壬基酚的基质固相分散萃取方法。内分泌干扰物，如邻苯二甲酸醋类物质，双酚A，壬基酚，阿特拉津等一般难溶于水，在
23、水中痕量存在，难以直接测定，需要对其进行富集浓缩。传统的预处理方法有液液萃取（LIQUIDLIQUIDEXTRACTION，LLE），蒸馏（DISTILLATION）等，这些方法目前已被固相萃取（SOLIDPHASEEXTRACTION，SPE）等更高效的预处理方法所取代蒸汽蒸馏和液液萃取技术操作复杂，固相萃取技术和固相微萃取技术将样品分离和浓缩合为一步，技术设备简单，操作灵活高效。SPE非常适用水中痕量有机物的富集处理，该技术的最大的特点是有机溶剂消耗少，节省预处理时间，从而减少对环境造成的二次污染，目前，文献报道的水中壬基酚的富集技术基本上集中在SPE技术的应用。今后酚类环境激素样品前处理
24、方法的研究趋势是进一步改进现有前处理方法的缺点，寻找少用或不用溶剂，低成本，易操作，高效和适合于多种样品的分离方法。（2）环境样品的固相萃取方法固相萃取（SOLIDPHASEEXTRACTION，简称SPE）是从八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术，由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来。主要通过固相填料对样品组分的选择性吸附及解吸过程，实现对样品的分离纯化和富集。主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。常用的固相萃取装置有固相萃取柱（包括SPE小柱和96孔板）和固相萃取装置（包括真空SPE装置和自动化固相萃取装置），常见的固相萃取柱分为三部分医用聚丙烯柱管，多孔聚丙烯筛板（20
25、UM）和填料（多为4060UM，80100UM）常用规格有100MG/1ML,200MG/3ML,500MG/3ML,1G/6ML等。以100MG/1ML,为例，其中100MG为填料的质量，1ML,为空柱管的体积。同时，为避免交叉污染，保证检测可靠性，SPE柱通常是一次性使用的。固相萃取填料常见的填料共分为四类1键合硅胶，如C18,C8,C4，C2,苯基等。（2）高分子聚合物，如PEP，PAX，PCX，PS等。（3）吸附型填料，如FLORISIL（硅酸镁），PESTICARB（石墨化碳），氧化铝。（4）混合型及专用柱系列，如磺胺专用柱，磺酰脲除草剂专用柱。对于固相萃取填料按保留机理可以分为正相
26、萃取、反相萃取，离子交换萃取和混合型萃取。222环境样品中壬基酚的检测分析方法宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析7（1）环境样品中痕量壬基酚的检测方法研究进展目前，对于痕量酚类化合物分析方法有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱质谱联用、高效液相色谱质谱联用、极谱法和流动注射发光法等。近年来，将GC及HPLC应用于酚类化合物的测定已有相当多的文献报道。气相色谱法具有较高的色谱分辨率，应用于测定酚类环境激素时，需进行衍生化反应。陈玲等采用自动固相微萃取气相色谱（SPMEGC）联用技术测定珠江水样和造纸工业废水中的壬基酚，该方法的检测限为20G/L。LI等人采用气相色谱质谱联用技术测定了悬
27、浮沉积物中的烷基苯酚。高效液相色谱法是20世纪60年代后发展起来的一种快速分离分析技术，在有机物的分析测定中占主导地位。CARERI等采用带紫外检测器的液相色谱对地下水中痕量壬基酚进行检测，检测限达017036UG/ML。邵兵利用LCMS联用技术，溶剂萃取，分析了动物组织中壬基酚，检出限为03UG/KG。也有将物理学物分析应用于NP检测报道。ANDREY等通过MANNICH反应使NP与牛血清白蛋白BSA结合，制备出了NP的多克隆抗体，利用该抗体通过ELISA方法对NP进行了检测，检测灵敏度达10NG/ML。JULIA等利用荧光偏振免疫技术进行了壬基酚的测定，检测限为7UG/ML。目前，高效液相
28、色谱法仍是测定环境中痕量壬基酚的主要方法。（2）高效液相色谱方法概述高效液相色谱法（HIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHY,HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。色谱法的分离原理色谱法是利用溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用的大小、强度不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固
29、定相中流出，又称为色层法、层析法。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长。高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需要高压输送流动相，故又称为高压液相色谱法（HPLC）。高效液相色谱法的定性及定量HPLC通过保留时间进行定性，保留时间是指被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也既从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间。保留时间是由色谱过程中的热力学因素所决定
30、，在一定的色谱操作条件下，任何一种物质都有一确定的保留时间，有着宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析类似于比移值相同的作用，因此可作为色谱定性分析的依据。HPLC定量是依据峰面积和样品量的线性关系，被测组分的量与响应值峰高或峰面积成正比。常用的定量方法有内标法和外标法，外标法在液相色谱中用得最多，外标法有以下特点无需各组份都被检出、洗脱；需要标样；标样及样品测定的条件要一致；进样体积要准确。其计算公式有以下两个校正因子RF（XI）标样浓度C（XI）/标样响应值RXI未知组分的浓度CIRF（XI）样品响应值AIHPLC的特点和优点HPLC有以下特点压力可高达150300KG/CM2。色谱柱
31、每米降压为75KG/CM2以上。流速为01100ML/MIN。塔板可高达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种，紫外检测器灵敏度可达001NG，同时消耗样品少。HPLC与经典液相色谱相比有以下优点速度更快，通常分析一个样品在1530MIN，有些样品甚至在5MIN内即可完成。分辨率更高，可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度更高，紫外检测器可达001NG，荧光和电化学检测器可达01PG柱子可反复使用。用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。高效液相色谱系统的组成HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数
32、据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。由于壬基酚挥发性较差，因此使用HPLC对其进行测定是很适合的方法，测定时常用紫外或荧光检测器。宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析93样品的采集与实验方法31采样点的布置及样品采集311采样点的布置宁波市海域总面积为8233KM2，岸线总长为1594KM，面积在500M2以上的岛屿531个，面积52407KM2；陆域南北长192KM、东西宽175KM，总面积9365KM2，内陆江河水网纵横
33、，湖塘水库棋布，丰富的渔业资源和良好的区位条件为宁波市渔业发展提供了得天独厚的条件。到2010年，全市水产养殖面积达到68654HA，养殖产量达到475万吨，其中海水养殖产量达到39万吨，淡水产量达到85万吨，养殖总产值达到564亿元。其中浅海养殖区4563HA、滩涂养殖19161HA、海水池塘养殖区16187HA、淡水池塘养殖区8102HA、外荡养殖区6408HA、水库生态养殖区8817HA、山塘养殖区231HA、临时养殖区5185HA。根据宁波市养殖业空间布局及化工企业布局情况选择监测点位和宁波市海洋渔业局对水产品产量及养殖面积的统计（2010），统计如下单位吨表31宁波市水产品产量及养殖
34、面积统计（2010）水产品总产量江北北仑镇海鄞州208877378117227089海产品海洋捕捞950029732894646海水养殖25761265572远洋渔业101976548养殖面积海水养殖面积（公顷）9662001282淡水养殖面积（公顷）4928778855090综合选择各地区采样点，采样点布置位置分布如图31，具体地理位置见表32。表32采样点位置采样点位置标注GPS定位内河（宁波大学）A镇海围垦滩涂区B东经12140393北纬300556柴桥C东经12155018北纬2952392庄市勤勇村D东经12138445北纬2955341宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析城湾
35、水库E东经12150134北纬2950373姚江F东经12133248北纬2953441鬼角礁东经12200191北纬2949305图31采样点布置图312样品的采集及保存1完成采样前的准备工作，准备好标签纸、玻璃采样瓶、笔、记录纸，GPS等。2确定采样点位宁波市内河（宁大新村）、镇海围垦区（镇海区）、柴桥、庒市勤勇村、姚江、鬼角礁、城湾水库。3采集水样用采水器采集表层水样（距离水面05M），采集水样2L，置于棕色玻璃瓶中，用磷酸调节至PH4，以拟制微生物的活动；用GPS进行定位，记录经纬度数值；运至实验室处理，水样经玻璃纤维滤膜（045微米，使用前在450度下焙烧4小时）过滤，保存于零下4度
36、，第二天进行样品的预处理。32实验方法321仪器和试剂1仪器UVD170U检测器，ASI100AUTOMATEDSAMPLEINJECTOR自动进样器，THERMOSTATTEDCOLUMNCOMPARTMENTTCC100柱温箱，P680HPLCPUMP泵，KUDOSSK2200H超声波清洗器，SIIZIII型循宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析11环水真空泵，固相萃取装置（MEDIWAX12），电子天平。2试剂甲基叔丁基醚、甲醇、乙腈均为色谱纯（美国TEDIA公司）；壬基酚（TECHNICAL,CAS15629000，保存于204，购自德国DREHRENSTORFER实验室）；超纯
37、水；壬基酚贮备液减量法取适量的壬基酚标准物质，用甲醇稀释，配制成浓度为100G/ML；所配置储备液置于冰箱中4保存；标准溶液用甲醇稀释100G/ML的贮备液，配制成浓度为20G/ML的标准溶液；工作溶液用水稀释100G/ML的贮备液，配制成浓度为20G/ML的工作液；322样品预处理过滤后的水样经PEP反相萃取柱分离和富集（AGELA，CAT0603，60MG/3ML），PEP柱的固相萃取填料以改性的聚苯乙烯/二乙烯为基质，填料表面同时具有亲水性和憎水性的基团，对各类极性、非极性化合物具有较均衡的吸附作用，PH使用范围为114，其吸附能力和样品容量远高于C18键合硅胶。样预处理实验步骤如下1萃
38、取柱活化用30ML甲基叔丁基醚（MTBE）活化小柱，流速约3ML/MIN，排废液至溶剂废液瓶中；用30ML甲醇活化小柱，流速约3ML/MIN，排废液至废液瓶中。（2）上样调整提取液的PH值（用磷酸调整）使目标组分呈分子形式，将1000ML水样上样到小柱中，流速3ML/MIN。（3）淋洗用50ML去离子水润洗小柱，排废液至废液瓶中，流速3ML/L，之后空气干燥20MIN。（4）洗脱用2ML甲基叔丁基醚分两步洗脱，收集洗脱液至样品瓶中，将收集的洗脱液用氮气吹干，样品于4条件下保存备用。宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析图32固相萃取装置323高效液相色谱仪实验操作1高效液相色谱仪使用前准备
39、工作接入稳定电源；打开稳定开关按下稳压电源工作电源开关至“ON”状态；更换泵头清洗瓶中去离子水；更换托盘里洗针瓶中的洗液洗液为50甲醇，50经过滤两遍的去离子水；流动相的混匀与过滤去离子水用045UM的一次性过滤膜过滤，过滤两次。流动相的超声脱气对甲醇和过滤好的去离子水以及乙进行超声脱气，采用KUDOSSK2200H超声波清洗器脱气15MIN。2排泵内气泡打开仪器电源电源一般在一起的后面板上排泵内气泡拧松泵右侧的快速清洗阀（反时针两圈左右）按下泵前面板右下方的“PURGE”键，仪器以60ML的速度自动清洗泵内残留的气泡，5MIN将自动停止。将四个通道分别排气泡后，拧紧快速清洗阀（顺时针拧紧，注
40、意不要拧的过紧）。4个通道中A通道的是乙腈，C、D流通的是甲醇，B通道流通的是去离子水。3软件的基本使用宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析13打开电脑，连接CHROMELEON工作站；进行泵的设置，设置流速，流动相比例等条件；自动进样器的设置，设置进样位置，进样体积，进样速度等条件；进行柱温箱相关参数的设置；进行检测器的设置，设置检测器采集通道的检测波长、参比波长、带宽等参数；采集基线4分析样品前的准备工作系统的准备第一步分析样品前先用甲醇冲洗流路约20分钟，平衡活化色谱柱，并赶走管路中的杂质和水分。第二步按照分析样品的需要调节比例阀的比例后冲洗流路约20分钟，待基线走平后即可进样。分
41、析样品的准备将富集浓缩的备用样品用甲醇定容至1ML，待测。洗针按自动进样器面板上的“WASH”键，洗针并排掉针中残留的气泡。5分析条件液相色谱柱PHENOMENEXLUNAC18柱（250460MMID5M，100A）；流动相V（乙腈）V（水）9010；流速10ML/MIN；柱温25；检测波长230NM；进样量10L；324HPLC条件的优化本论文主要对HPLC流动相及比例、流速等条件进行了优化。1流动相的选择反相液相色谱的流动相多选用甲醇、乙腈、水等，由于乙腈的洗脱能力最佳，所以选用了乙腈和水作为流动相。2检测波长选择的检测波长分别为227NM、230NM、2238NM、300NM。通过比较
42、峰形，选择230NM时最优。宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析3实验方案本实验方案设计如下表33流动相的比选方案流动相比例柱温柱压流速标准溶液的浓度进样体积参比波长V（甲醇）V（水）901020790BAR10ML/MIN20UG/ML10UL600NMV（乙腈）V（水）901020790BAR10ML/MIN20UG/ML10UL600NM表34HPLC分析条件的优化方案（流动相为乙腈/水）色谱条件方案1方案2方案3方案4方案5方案6乙腈水901090109010901070305050柱温207207207207207207柱压89BAR95BAR0BAR97BAR133BAR19
43、4BAR流速05ML/MIN10ML/MIN01ML/MIN10ML/MIN10ML/MIN10ML/MIN采集时间20MIN9MIN30MIN30MIN27MIN30MIN样品浓度20UG/ML20UG/ML20UG/ML20UG/ML20UG/ML20UG/ML进样体积10UL10UL10UL10UL10UL10UL参比波长600NM600NM600NM300NM600NM600NM宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析154结果与分析41HPLC条件的优化结果411流动相的比选结果1流动相V（甲醇）V（水）选择V（甲醇）V（水）9010作为流动相时，配置20UG/ML的标准溶液上机检
44、测，检测波长为230NM，标准品色谱图如下图41标准品的色谱图（V（甲醇）V（水）9010）实验过程中所进样品为壬基酚异构体混合物标准品，以V（甲醇）V（水）为流动相，实验了不同比例的流相动，其色谱图出峰杂乱，不能以保留时间进行定性确定分析物的色谱峰。以V（甲醇）V（水）为流动相使会仪器具有较高压力，流动相V（甲醇）V（水）9010时，泵压力约在98BAR，调整为V（甲醇）V（水）7330时，压力可增至160BAR左右。同时，实验中发现，以V（甲醇）V（水）为流动相，泵压力会随着实验次数的增加而明显升，HPCL压力分析条件不稳定会影响实验的定性及定量结果。2V（乙腈）V（水）9010方案选择V
45、（乙腈）V（水）9010作为流动相时，配置20UG/ML的标准溶液上机检测，标准品色谱图如下宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析图42标准品的色谱图（V（乙腈）V（水）9010）实验过程中所进样品为壬基酚异构体混合物标准品，以V（乙腈）V（水）9010为流动相，色谱峰少，且型较好，经空白对照可确定标准品的保留时间为726MIN，以V（乙腈）V（水）为流动相时，泵压力值较低，且分析过程中压力值较稳定，随着流动相比例的改变，压力值变化幅度较小。因此可以确定使用V（乙腈）V（水）为流动相可保持仪器分析条件的稳定性。412乙腈/水为流动相HPLC分析条件的优化样品1145MIN出峰，峰较明显。实
46、验过程中所进样品为壬基酚异构体混合物标准品，以V（乙腈）V（水）9010为流动相，色谱峰少，且型较好，经空白对照可确定标准品的保留时间为145MIN，比标准品时间长了一倍。样品272MIN出峰，峰较明显。此即为标准品。样品330MIN内未出样品峰，峰的分离效果比较好，但费时。样品430MIN内未出峰，采集基线时有峰。宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析17样品5226MIN出峰，峰形较宽较矮，色谱图如下图43样品5色谱图样品3、4、5与标准品相比均为保留时间过长，不利于进行实验操作。样品61H内未检测到峰，其色谱图如下图44样品6色谱图考查了几种不同混合比的流动相，通过比较其峰形、灵敏度
47、及信号采集时间，最终选择流动相为V（乙腈）V（水）9010；流速为10ML/MIN；检测波长为230NM；参比波长为600NM。选择该方法保留时间较短，利于实验操作。宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析42方法回收率、检出限及线性范围421方法回收率方法回收率通过基质加标来计算，具体方法如下1将已过045M滤膜的环境水样，用上述方法测出其中的NP的含量；2进行3个样品单独加标测定，加标量为10UG。按同样的方法测定其中的NP含量，扣除水样本底量，计算方法的回收率，结果见下表表41方法的回收率（N3）目标化合物回收率/相对标准偏差NP样品A样品B样品C955483197699以下为3个样品
48、的色谱图图45样品A色谱图宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析19图46样品B色谱图图47样品C色谱图宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析图48样品A的加标回收色谱图图49样品B的加标回收色谱图宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析21图410样品C的加标回收色谱图422检出限方法的检出限基于LOD计算得到，其方法为1L的水样经过萃取浓缩到1ML，进样量量10L，样品在处理过程中做1个样品空白，同时加一个标准溶液（20G/ML）。通过对同一个标准溶液所得相对标准偏差来衡量仪器的稳定性。这是美国环保局推荐的估算LOD的方法，用标准曲线和计算误差平方根来估算，RMSE方法包括如下步
49、骤（1）用标准品做4至5个点的标准曲线，标准品的浓度在一个数量级范围内。为此，检测限可估算为三倍噪声所对应的浓度，用检测器信号（X）对应浓度（C）绘制标准曲线。（2）做出标准曲线的回归方程，计算出几个标准品（N）的斜率（M）、截距（I）和相关系数R2。（3）标准曲线可用如下方程表示XMCI（4）依据斜率（M）和截距（I）计算每个标准品预计的对应信号值XP。（5）计算每次测量的误差（E）|XPX|（6）计算每个标准品点的误差的平方，取这些点N的误差平方的总和（E2）。（7）RMSE可按如下公式计算宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析212NERMSENJJ仪器的检出限（LOD）定义为S/N3时的进样浓度，该方法NP的仪器检出限为5UG/L，经浓缩倍数置换，方法检出限为5NG/L。423线性范围将贮备液稀释成浓度为1G/ML、2G/ML、5G/ML、10G/ML、20G/ML、50G/ML的标准液，将标准溶液按上述方法进行HPLC分析，然后作标准曲线。图41120G/ML标准溶液的色谱图（一）宁波市养殖水域典型环境激素污染现状调查分析23图
