1、毕业论文 文客久久 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 鮟鱇鱼鱼肉酶解蛋白产物的制备及抗氧化肽活性的研究 学 院： 学生姓名： 专 业： 药学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 文客久久 目录 鮟鱇鱼鱼肉蛋白酶解产物的制备及抗氧化活性研究 . 2 1 前言 . 4 2 材料与方法 . 4 3 结果与讨论 . 6 3.1单因素试验 . 6 3.2酶解工艺条件优化 . 8 3.3 酶解液超滤分段 . 9 3.4鮟鱇鱼抗氧化肽的纯化 . 10 参考文献 . 13 毕业论文 2 鮟鱇鱼鱼肉蛋白酶解产物的制备及抗氧化活性研究 摘 要 目的：研究鮟鱇鱼鱼肉蛋白酶解产物的制备工艺及抗氧化活性
2、。方法：以 DPPH清除率为指标，通过单因素实验和正交试验确定胰蛋白酶最佳酶解条件，经超滤、 DEAE-52离子交换色谱和 Sephadex G-25 进一步分离 、提纯，检测各组分的抗氧化活性。结果：胰蛋白酶酶解鮟鱇鱼鱼肉蛋白制备抗氧化肽的最佳酶解条件为：温度 30C 、酶解时间 4h、加酶量1.0%、料液比 1:3；酶解产物经超滤后得到三个组分 LMH- (MW10kDa)、 LMH- (1010kDa） LMH- (10MW5 kDa) and LMH- (MW5kDa) were fractionated from LMH by ultrafiltration membrane sys
3、tem and LMH- showed higher antioxidant activity in the three fractions, F11 subfraction with stronger antioxidant activity were obtained from LMH- by ion-exchange and gel filtration chromatography. The DPPH scavenging activity of F11 was 49.5% at the concentration of 5.0 mg/mL. Conc lusion The bioac
4、tive peptides from Lophius litulon had a strong antioxidant capacity in vitro after enzymatic digestion 、 ultrafiltration 、 and purification on ion-exchange and gel filtration chromatography. Key words: Lophius litulon; enzyme hydrolysate; antioxidative activity 毕业论文 4 1 前言 人体在正常生理情况下，自由基的产生与清除处于动态平
5、衡中，但是过量的自由基会使氨基酸、蛋白质、脂肪酸等受到强烈的氧化破坏，使它们的化学结构发生改变，造成相关细胞结构和功能的破坏，从而导致许多疾病发生 1。因此，自由基的清除对维持人体正常的生理活动具有重要的意义。研究发现，通过酶解法获得的分子量介于蛋白质和氨基酸之间的肽类具有极强的活性 2，使其成为蛋白质类物质中最有前途的抗氧化物质 3。蛋白质可成为产生活性肽的原料 4，上世 纪 70 年代， Hale 等人发现胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶比较适合鱼肉蛋白的水解 5，其中胰蛋白酶是特异性最强的酶。所以，通过蛋白质的酶解技术可得到天然的抗氧化活性肽，以满足人们对天然抗氧化剂的追求 6。 近年来，
6、随着人们对安康鱼认识的逐渐深入，对安康鱼研究也开始深入。目前，人们对鱼药用的研究主要集中在，鱼甘油和鱼肉蛋白当中。 鮟鱇鱼（ Lophius litulon），又名又名蛤蟆鱼、结巴鱼等，属冷温性底层鱼类，在我国主要分布在黄渤海地区及东海北部，其肉鲜美，富含维生素 A 和维生素 C，如今已成为我国主要渔获 种类之一 7。 安康鱼全身都可以食用，而且所含脂肪低、热量少，更富含丰富的维他命 A、D 和 E，尤其是鱼肝有保持视力、预防肝脏疾病等功效。 经常食用具有很好的滋补作用能够预防高血压、心血管、风湿痛等疾病。近年来，利用酶水解动植物蛋白制备蛋白水解物的研究与开发已成为生产高附加值生物产品的一个热
7、点。 但目前对鮟鱇鱼的研究尚少，对其开发利用仍处于食用阶段。 本实验 利用正交实验对胰蛋白酶酶解制备鮟鱇鱼蛋白抗氧化肽的工艺进行了优化，并利用超滤、 DEAE-52 离子交换色谱和 Sephadex G-25 从酶解物中分离得到了活性较高的 抗氧化组分，研究结果为鮟鱇鱼蛋白抗氧化肽的开发提供了依据。 2 材料与方法 2.1 材料与试剂 2.1.1 材料 鮟鱇鱼（ Lophius litulon）购于浙江舟山市南珍市场， 种属由浙江海洋学院赵盛龙教授鉴定为黄鮟鱇 Lophius litulon，标本存放于浙江海洋学院药学实验室。 2.1.2 试剂与仪器 胰蛋白酶（上海国药集团化学试剂有限公司）、
8、 DPPH（美国 sigma 公司）、 DEAE-52 离子交换树脂、 Sephadex G-25 凝胶（上海源聚生物科技有限公司）， 磷酸二氢钠 、 磷酸氢二钠 、 铁氰化钾 ， 其它试剂 均为分析纯自动部分收集器（上海琪特仪器分析有限公司） UV-1100 紫外可见分光光度计（上海美谱达公司） MSC300 超滤杯（上海摩速科学器材有限公司） CF16RXII高速冷冻离心机（日本 HITACHI 公司） 2.2 实验方法 毕业论文 5 2.2.1 鮟鱇鱼胰蛋白酶解液制备 将鮟鱇鱼去皮、内脏和鱼骨，收集鱼肉，经组织捣碎机搅拌均匀制成肉糜，分袋包装并密封，于冰箱 -20 保存 。 参照 Qua
9、glia， G.B.等人 8对沙丁鱼的酶解方法并做部分修改。精确称取一定质量的鮟鱇鱼肉糜，按照一定比例加入超纯水与胰蛋白酶，一定温度水浴 进行酶解，酶解完成后将酶解液于 100 水浴中加热 15min 灭酶，冷却至室温后 4 ， 4000r/min， 5min 离心，得上清液，12000r/min 离心 20min，收集上清液冷冻干燥备用。 2.2.2 胰蛋白酶酶解工艺优化 8 以 DPPH 清除率为指标考察料液比、加酶量、酶解温度、酶解时间对胰蛋白酶酶解制备鮟鱇鱼蛋白抗氧化肽的影响。结果如图 2 5 所示。 根据单因素试验设计正交试验确定胰蛋白酶酶解制备鮟鱇鱼蛋白抗氧化肽的工艺条件。L9（
10、34） 正交试验设计因素和水平见 表 1。 表 1 因素水平表 Table 1 The design of fac tors and the level 水平 因素 A 料液比 B加酶量 (%) C酶解温度 ( ) D酶解时间 (h) 1 1:1 0.5% 30 2 2 1:2 1% 40 3 3 1:3 1.5% 50 4 2.2.3 鮟鱇鱼抗氧化肽分离纯化 2.2.3.1 鮟鱇鱼活性肽初步分离 将最佳酶解条件下得到的鮟鱇鱼胰蛋白酶解液经截留分子量为 10kDa 和 5KDa 的超滤膜超滤后，分别得到 LMH- （ MW 10kDa）， LMH- （ 10kDa MW 5kDa）， LMH-
11、 (MW 5 kDa）三个组分。将以上三个组分冷冻干燥后测定其 DPPH 自由基清除率，选择活性高的进一步分离纯化。 2.2.3.2 鮟鱇鱼抗氧化肽进一步分离纯化 以 DPPH 清除率为指标，将 LMH 超滤后所得 3 个组分中活性较高的部分过 DEAE-52 阴离子交换色谱，流动相为水、 0.1mol/L NaCl、 0.5mol/L NaCl 和 1.0mol/L NaCl 梯度洗脱，流速为 2mL/min，部分收集器每 3min 一管进行收集，洗脱液在 280nm 下检测，合并各峰，测定其DPPH 自由基清除率，选择较强组分过 Sephadex G-25 凝胶柱，以超纯水为流动相，洗脱速
12、度为 2mL/min，部分收集器每 3min 一管进行收集，洗脱液在 280nm 下检测，合并各峰后测定其DPPH 自由基清除率。 2.2.3.3 DPPH 清除率的测定 DPPH 自由基清除能力按照 Bersuder（ 1998） 描述的方法进行。 1mL 样品与 1mL 的 99.5%毕业论文 6 乙醇混合，加入 500 l DPPH浓度为 0.02% 的 99.5%乙醇溶液。混合物在暗室室温下放置 30分钟，于 517 nm 处测定吸光值。 自由基清除率按照下面公式计算：清除率 % =（对照 +空白 -样品） /对照。 对照： 1mL 蒸馏水 + 500 l浓度为 0.02% DPPH
13、99.5%乙醇液 + 1mL 乙醇； 样品： 1mL 样品 + 500l浓度为 0.02% DPPH 99.5%乙醇液 + 1mL 乙醇； 空白： 1mL 样品 + 500 l乙醇 + 1mL 乙醇。 3 结果与讨论 3.1 单因素试验 3.1.1 料液比 对 DPPH 自由基清除率 的影响 在加酶量为 1%、温度为 40 、酶解时间为 3h 的条件下，改变料液比大小，酶解液 DPPH清除率随料液比的变化如图 1 所示。由图可知， DPPH 清除率在料液比为 1:2 时达到最大值，随后随着比值增大 DPPH 清 除率降低，故 1:2 为最佳料液比。 为节约能源，提高效率选取料液比为 1： 1、
14、 1： 2、 1： 3,为正交实验水平。 3.1.2 加酶量 对 DPPH 自由基清除率 的影响 在料液比为 1:2，温度为 40 ，酶解时间为 3h 的条件下，改变加酶量，酶解液 DPPH 清除率随加酶量的变化如图 2 所示。由图 2 可知，当加酶量为 1.5%时，清除率达到最大，故选择加酶量为 1.5%为最佳条件。 为节约能源，提高效率加酶量 0.5%、 1%、 1.5%为正交水平。 3.1.3 酶解温度 对 DPPH 自由基清除率 的影响 在料液比为 1:2、加酶量为 1.5%、酶解时间为 3h 的条件下，改变酶解温度， DPPH 清除率随温度的变化如图 3 所示。由图可知，酶解温度为
15、40 时， DPPH 清除率最高，故 40 为理想酶解温度。 为节约能源，提高效率选取温度为 30、 40、 50 为正交水平。 3.1.4 酶解时间 对 DPPH 自由基清除率 的影响 在料液比为 1:2、加酶量为 1.5%、酶解温度为 40 下，改变酶解时间， DPPH 随时间的变化如图 4 所示。由图可知，酶解时间为 3h 时， DPPH 清除率达到最大，故选择 3h 为最佳酶解时间。 为节约能源，提高效率选取 2、 3、 4 小时为正交实验水平。 毕业论文 7 01020304050600 1 2 3 4 5 6料液比值DPPH清除率（%）图 1 料液比对 DPPH 清除率的影响 Fi
16、g.1 Effects of liquid-solid ratio on the DPPH scavenging rate 2025303540455055600 0.5 1 1.5 2 2.5 3加 酶 质 量 （ % ）DPPH清除率(%)图 2 加酶量对 DPPH 清除率的影响 Fig.2 Effects of enzyme concentration on the DPPH scavenging rate 毕业论文 8 2030405060708020 30 40 50 60 70 80温度（）DPPH清除率(%)图 3 酶解温度对 DPPH 清除率的影响 Fig.3 Effects
17、of temperature on the DPPH scavenging rate 5557596163656769711 2 3 4 5 6 7时 间 ( h )DPPH清除率图 4 酶解 时间 对 DPPH 清除率的影响 Fig.4 Effect of enzymolysis time on the DPPH cavenging rate 3.2 酶解工艺条件优化 在单因素试验的基础上，采用 L9(34)正交试验确定鮟鱇鱼蛋白胰蛋白酶解的最佳条件（表2）。对正交试验结果进行极差分析，结果显示影响胰蛋白酶酶解物对 DPPH 自由基清除活性的各因素排序为： B A C D，即加酶量的影响最大
18、，酶解时间影响最小。其最佳酶解条件为 A3 B2C1D3，即料液比为 1:3，加酶量为 1%，酶解温度为 30 ，酶解时间为 4h。在最佳酶解条件下，浓度 10mg/mL 的酶解液对 DPPH 自由基清除率可达到 80.11% 表 2 胰蛋白酶酶解物对 DPPH 清除作用 Tab.2 The scavenging effect of hydrolysastes produced by trypsin on DPPH 毕业论文 9 酶解条件 序号 conditions of hydrolysis 清除率 No. A B C D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 k1 k2 k
19、3 R 1 1 1 2 2 2 3 3 3 161.9 215.83 162.12 53.967 72.877 54.040 18.290 1 2 3 1 2 3 1 2 3 181.43 211.39 147.03 60.477 71.407 49.010 22.397 1 2 3 2 3 1 3 1 2 209.79 159.25 167.81 70.930 53.083 56.880 17.847 1 2 3 3 1 2 2 3 1 156.07 186.92 193.88 53.960 62.307 64.627 10.667 58.44 59.87 43.59 70.18 71.41 74.24 52.81 80.11 29.2 3.3 酶解液超滤分段 将酶解液分别经截留分子量为 10kDa 和 5kDa 的超滤膜后，得到 LEH- (MW 10kDa)、LEH- (10 MW 5 kDa)和 LEH- （ MW 5 kDa）三 个组分，测定其 DPPH 自由基清除率，结果分别为 30.17%， 26.43%， 57.1%结果如图 5。
