1、毕业论文 文客久久 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 双髻鲨鱼肉蛋白抗氧化肽的工艺研究 学 院： 学生姓名： 专 业： 药学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 文客久久 双髻鲨鱼肉蛋白抗氧化肽的工艺研究 文摘 受 DPPH 清除试验的启发，已经发展出一种有效的方法即采用 正交试验设 L9(33)去获得双髻鲨肌肉蛋白的水解产物。 在最佳酶解参数（酶解时间 2 小时，酶量为总重量 1.0%，酶解温度 60C 、 PH为 6） ，浓度为 25mg/ml 下， 双髻鲨肌肉蛋白的 DPPH 清除率为 91.53 2.47 %。酶解时间在制备中起重要作用（ p10kDa），通过超滤膜方法
2、可从双髻鲨肌肉蛋白中分离开来，其中 SPH-I 抗氧化活性最强。 经 DEAE-52纤维素阴离子交换层析，葡聚糖凝胶 G-25凝胶过滤柱和反相高效液相色谱法，具有最高的抗氧化活性肽（ SAP）从 SPH I 中分离纯化后，它的序列确定为亮氨酸，天冬氨酸，赖氨酸。 SAP 的抗氧化活性是由于较小的规模，存 在于 抗氧化氨基酸和它们在序列中的特殊位置。这些结果表明，来自双髻鲨肌肉蛋白的水解产物，片段和肽可以用来作为天然的氧化剂来增加保健食品的抗氧化性能，防止食品加工生产中的氧化。 关键词 双髻鲨，水解产物，抗氧化活性，肽 1. 介绍 脂质和脂肪酸氧化 产生自由基，从而导致不良异味的产生，气味和潜在
3、的毒性反应形成产物。 (Lin Bougatef et al., 2010; Gimnez, Alemn, Montero P, Bougatef 等人， 2010 年，希门尼斯阿莱曼蒙特罗带够，戈麦斯 - 吉兰， 2009）。此外，癌症， 冠心病患者和 阿兹海默病 据报道一部分也是 人体内的氧化或自由基反应引起的 。 (Bougatef et al., 2010; Diaz, Frei, Vita, ， A0 吸光度对照组 ; A“是空白吸光度。 2.10统计分析 所以完成的实验都一式三份， ANOVA 检验（采用 SPSS16.0 软件）是用来比较各处理的平均值。 参数的手段之间的显著差异
4、是 用邓肯的多个范围测试（ P 0.05）。 3.2 SPH 酶解参数的优化 在下面的测试中，选定的四个因素（酶解时间，酶解总量，酶解温度和 pH） 根据单因素实验设计的结果 使用正交采用 L9（ 3） 4试验设计 进一步 优化 。 结果如表 1 所示。根据 R 值，影响水解物的抗氧化活性为 A B D C. 酶解时间是 SPH 抗氧化活性的最重要因素。通过验证测试， DPPH 自由基清除率在 最佳酶解水平 A2B3C3D2,处达到最高值为 91.53 2.47 ，也就是说， 获得最高的抗氧化 SPH 的最佳条件为：酶解时间 2 小时，总酶量 1.0，酶解温度 60， pH 值 6。 毕业论文
5、 文客久久 表 1. 正交矩阵阵列设计 L9（ 34）和实验结果（ c = 25 mg/mL） No Factor DPPH scavenging activity (%) A Enzymolysis time (h) B Total enzyme dose (%) C Enzymolysis temperature (C ) D pH 1 1 0.6 50 5 55.713.40 2 1 0.8 55 6 68.742.44 3 1 1.0 60 7 65.803.01 4 2 0.6 55 7 61.231.35 5 2 0.8 60 5 76.212.93 6 2 1.0 50 6 80
6、.923.11 7 3 0.6 60 6 54.392.61 8 3 0.8 50 7 55.462.00 9 3 1.0 55 5 54.213.01 k1 190.258.85 171.337.36 192.098.15 186.139.34 k2 218.367.39 200.417.37 184.186.80 204.058.16 k3 164.067.62 200.939.13 196.408.55 182.496.36 Best level A2 B3 C3 D2 R refers to the result of extreme analysis K1 63.422.95 57.
7、112.45 64.032.84 62.043.11 K2 72.792.46 66.802.46 61.392.27 68.022.72 K3 54.692.54 66.983.04 65.472.85 60.832.12 R 18.1 9.87 4.07 7.19 R order A B D C 方差分析结果（见表 2）表明， P0.05,总酶剂量和 pH 值对 SPH 的活性无显著影响。 表 2.正交设计的方差分析测试 (F0.05, (2, 2) = 19) Source Sum of square d.f. Meansquare F P significance A 163.873
8、2 81.937 19.198 P 0.05 Insignificant C 8.536 2 4.268 D 29.600 2 14.800 3.468 P 0.05 Insignificant 3.3 超滤膜 肽的分子量是生物活性的关键因素之一。使用三种不同分子量得膜分馏 SPH， 四组分进行分离，分别命名为： SPH-I (MW 10 kDa),图 2 表明，在浓度测试中，大部分的肽表现出较高的 DPPH自由基清除能力与 SPH 水解相比。 SPH I 表现出最强的清除活性。 在 5mg /ml 的浓度下，SPH-I 的自由基清除率达到 25.761.20 %，是 SPH 的 187%。这
9、一结果与早先报到的特别是在生物反应的范围较活跃的的一些低分子量一致。 包括 抗氧化能力。 (Jun, Park, Jung, Adibi Silk et al., 1980; Guo, Kouzuma, Mendis, Rajapkse, Je, Park, Chen, Muramoto, Ranathunga, Rajapakse, Uchida, & Kawakishi, 1992).。 作为一个整体，规模较小，抗氧化的氨基酸序列中的特定定位可能已被归因于 SAP 的抗氧化活性。 4. 结论 我们的研究首次报道了通过木瓜蛋白酶从双髻鲨的肌肉蛋白中酶解抗氧化水解物。在常规实验中，以蛋白质 水
10、解度作为标准来评价水解过程 (Duan, Wang, Yang, & Dai, 2009)。 为了得到最有力的抗氧化活性的水解物， DPPh 自由基清除水解活性 被视为在我们的实验中的唯一准则，这给了我们在抗氧化肽的分离和提纯方面的更多帮助。 根据酶水解技术，当值超过峰值，酶解时间效应对 DPPH清除活性会减弱。它可能是由灭火的蛋白酶和酶解时间过长导致结构破坏所引起的。此外，以 R 值和方差分析的结果为基础，酶解时间被确认为影响自由基清除活性最重要的因素。 因此，酶解时间，在这个过程中需要严格控制。 对 SPH 的 DPPh 清除 活性， 其分数和纯化多肽进行了测试。 SPH-I 的分子量最小
11、（ MW1 kDa） ， 在各 SPH 和其四组分（为 SPH-I至 IV）中表现出对 DPPH 的最高抑制。 经 DEAE-52 纤维素阴离子交换层析， 葡聚糖凝胶 G-25 凝胶过滤柱和反相高效液相色谱法，来自于 SPH-I的 SPA 被确定抗氧化化活性最高，其氨基酸序列被确认为亮氨酸，天冬氨酸，赖氨酸。 SAP的抗氧化活性是由于较小规模，抗氧化氨基酸和在序列中的具体位置。 这些结果表明，水解，及其分离和纯化双髻鲨肌肉蛋白肽可以作为天然抗氧化剂来增强功能性食品的抗氧化性质，防止在食品加 工中的氧化反应。 致谢： 这项工作是由中国国家自然科学基金（编号 81001393），国家级星火计划项目
12、 2010GA700088）和浙江省自然科学基金（编号： Y2110636）的赠款资助。 参考 1 艾迪比，美国（ 1971）。在人类肠道运输二肽：水解和完整吸收的相对重要性。中国临床调查， 50 岁， 2266- 2275. 2 Adibi, S. A., & Phillips, E. (1968)。从肽的氨基酸的吸收，比从人体肠道中的自由形式的证据。临床研究， 16， 446。 3 Bougatef, A., Nedjar-Arroume, N., Lala, M., Ravallec, R., Barkia, A., Guillochon, D.,等。 （ 2010 年）。 sardin
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