1、毕业论文 - 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 大连长蛸群体 CYTB 和 COII 基因的遗传变异研究 学 院： 学生姓名： 专 业： 生物科学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 - 目录 中文摘要 .II 英文摘要 . III 引言 .1 1.实验材料与方法 .3 1.1 实验材料 .3 1.2 实验药品与试剂 .3 1.2.1 实验所用的基本试剂 .3 1.2.2 自配试剂 .3 1.2.3 琼脂糖凝胶板的制备 .4 1.3 主要仪器和设备 .4 1.4 实验耗材 .5 1.5 实验方法 .5 1.5.1 基因组 DNA 的提取 . 5 1.5.2 基因组 DNA 的检
2、测 .5 1.5.3 基因组线粒体基因的扩增 .6 1.5.4 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物 .7 1.5.5 扩增产物的序列测定和数据分析 .7 1.实验结果与分析 .8 2.1 基因组 DNA的提取结果 . 8 2.2 基因组线粒体基因的扩增结果 .8 2.3 大连长蛸群体遗传多样性分析 . 9 2.3.1 大连长蛸 CYTB基因片段的基本统计和分析 .9 2.3.2 大连长蛸 COII 基因片段的基本统计和分析 .11 3.实验讨论 .14 3.1 长蛸 DNA的 提取和线粒体基因的扩增 .14 3.2 大连长蛸群体的遗传多样性分析 .14 3.3 研究展望 .15 4.实验结论
3、 . 16 参考文献 .17 致谢 .19 毕业论文 - 大连长蛸群体 CYTB 和 COII 基因的遗传变异研究 摘 要 采用 PCR扩增技术对中国大连海域的长蛸群体的 CYTB和 COII两个线粒体基因片段进行了扩增和测序，分别得到了长度约为 650bp 和 480bp 的两段序列，分析了群体内的遗传变异。结果表明， 30尾长蛸个体中每段基因序列扩增均检测到两个单倍型。通过序列比对，样本个体间的序列差异不显著，无缺失、插入、颠换的现象，两段基因片段序列中均只有一个位点出现 碱基转换。 CYTB序 列的单倍型多样性指数为 0.556，核苷酸多样性指数为 0.00085，多态位点数为 1，且为
4、信息多态位点，平均核苷酸差异数为 0.556； COII 序列的 单倍型多样性指数为 0.389，核苷酸多样性指数为 0.00081，多态位点数为 1，且为信息多态位点，平均核苷酸差异数为 0.389。 COII 序列相对较保守， CYTB、 COII 两段序列的 A+T 的平均含量分别为 67.1%、 63.0%，均大于G+C 的平均含量。 通过本次研究，从线粒体 DNA 水平分析我国大连长蛸群体的遗传变异情况，期望为开展大连长蛸群体的资源评价、物种保护及分子标记育种提供基础资料。 关键词 长蛸； CYTB 基因； COII 基因；遗传变异 毕业论文 - Genetic variation
5、in Octopus variabilis population from Dalian sea area based on mitochondrial CYTB and COII genes amplification and analysis Abstract Fragments from two mitochondrial genes of Octopus variabilis sampled from Dalian in Liaoning province of China were amplified and sequenced. 650bp CYTB and 480bp COII
6、fragments were obtained. Two haplotypes were identified from 30 samples with each mtDNA fragment. There was no prominent difference among the group and no insertion, deletion or transversions were detected except for one transitions. CYTB sequence haplotype diversity index for the whole population w
7、as 0.556, nucleotide diversity index was 0.00085. Only one informative polymorphic site was detected, the average number of nucleotide differences was 0.556; COII sequence haplotype diversity index for the whole population was 0.389, nucleotide diversity index was 0.00081, one informative polymorphi
8、c site was also detected. The average number of nucleotide differences was 0.389. The mean A+T contents of CYTB, COII gene fragments were 67.1% and 63.0%, respectively, which exceeded the contents of G+C.The sequences of Octopus ocellatus in this study were compared with those of two groups coming f
9、rom Qingdao and Zhoushan. Prominent difference existed among different groups. MEGA 3.1 was used to analyze the base composition and genetic distance, and the NJ and MP phylogenetic trees were constructed. The phylogenetic relationship between these groups seemed to be completely consistent with the
10、ir the geographic distribution. Key words Octopus variabilis; CYTB gene; COII gene; Genetic variation毕业论文 - 引 言长蛸（ Octopus variabilis）是一种小型章鱼，又名坐蛸，隶属于软体动物门，头足纲，二鳃亚纲，八腕目，蛸科（章鱼科），主要群体栖居于温带偏北海域，是我国北方沿岸蛸类中最重要的经济种，在我国南北沿海地区，远东海、日本、朝鲜、印度尼西亚及新几内亚均有分布。其肉较嫩，味鲜美，可食部分达 95%，蛋白质丰富，含脂率高， 营养价值高， 具有很高的经济价值 1。也是我国传统
11、的出口海产 品，主要输往日本、意大利等国。然而 长蛸作为一个传统的捕捞经济水产种类，长期以来人类大量捕捞，致使资源受到严重损害， 近年来其资源呈明显下降乃至枯竭的趋势 。 因此合理开发利用长蛸资源，开展相应资源的增养殖势在必行。 对长蛸基础生物学的深入了解和认识是合理开发和利用的前提，近年来，有关长蛸的基础生物学研究也在国内外迅速开展起来，主要集中在养殖习性、生理生态、营养成分、人工繁殖、胚胎发育等方面 2,3,4，为今后的开发工作提供了第一手的珍贵资料。但至今还未有人从分子水平上对长蛸进行研究，不能适应当前长蛸等头足类研究 的需要。 物种遗传多样性研究是当前海洋生物分子生物学研究的重要内容，
12、是物种开发和保护的基础。 遗传多样性是指 存在于生物个体内、单个物种内以及物种之间所有遗传变异的总和 5。 它不仅是维持物种繁殖活力、抗病虫害能力和适应环境变化潜力的基础，也是人类利用改良、创造新的物种的源泉 6。因此对物种遗传多样性的研究和保护已成为现代生物学研究中的热点 7。而对于长蛸而言， 对现有群体进行遗传多样性监测和评估，是进行种质资源的管理和保护的前提之一，也是养殖业可持续发展和对养殖种类遗传改良的需要 8。 目前关于长蛸遗传多 样性的研究资料还非常少，在国内外仅见于等位基因酶的遗传变异研究 9，尚未从线粒体 DNA 上研究长蛸的遗传多样性。线粒体 DNA(mtDNA)作为细胞中的
13、相对独立的核外遗传物质，广泛的存在于生物体的各种组织细胞中，由于其具有分子量小、分子结构简单且稳定、母性遗传、一级结构进化速度快、突变率高、均一、无组织特异性等特征，易于分离纯化 10，重复性好，已成为研究动物起源进化，群体遗传分化及系统发育的理想研究材料 11，在渔业资源研究方面得到广泛应用 12。目前，随着 DNA 测序技术和分子信息学的快速发展，线粒体 DNA 作为一种优良的标记技术广泛的用于生物的遗传变异研究 13,14,15。线粒体 DNA 中细胞色素氧化酶第亚基(cytochrome oxidase subunit， CYTB)的 DNA 序列变异性较大 16，可提供毕业论文 -
14、丰富的 DNA 多态信息，是检测群体遗传变异的有效探针，在鱼类相关研究中已有应用 17，适合于种间和种内的系统发生研究 18,19； COII 基因片段中碱基AT 含量非常高，也比较保守，适合于种内或种间的群体遗传分析 20,21。 本文利用 PCR扩增产物直接测序的方法对来自辽宁省大连的 10个个 体的COII 和 CYTB 基因片段序列进行了测定和分析，从线粒体 DNA 水平分析我国大连长蛸群体的遗传变异情况，期望为开展大连长蛸群体的资源评价、物种保护及分子标记育种提供遗传学资料，同时与其他长蛸群体的序列进行了比较，为其种质资源的保护、管理以及对物种的起源进化及长蛸群体结构和遗传分化的研究
15、提供基础资料。 毕业论文 - 1 实验材料与方法 1.1 实验材料 长蛸成体样本 30 尾，采自于辽宁大连自然海域， 全部野生。 长蛸规格体长一般在 15-27cm，体重约 100 克，健康状况良好。 经鉴定后冰镇活体空运回实验室， 活体取肌肉 3-5g立 即冻存于 -70冰箱中备用，另外从山东青岛、浙江舟山自然海域采集长蛸样本作为外群对照。 1.2 实验药品与试剂 1.2.1 实验所用的基本试剂 去离子水：实验室自制 琼脂糖：中国医药上海化学试剂公司 氯仿：国药集团化学试剂有限公司 NaCl：国药集团化学试剂有限公司 浓盐酸：国药集团化学试剂有限公司 无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司 乙酸
16、钙：国药集团化学试剂有限公司 冰乙酸：国药集团化学试剂有限公司 酚：国药集团化学试剂有限公司 异戊醇：国药集团化学试剂有限公司 蛋白酶 K：宝生物工程（大连）有限公司 乙二胺四乙酸（ EDTA）：北京鼎国生物技术发展中心 三羟甲基氨基甲烷（ Tris）：国药集团化学试剂有限公司 十二烷基硫酸钠（ SDS）：宝生物工程（大连）有限公司 以上试剂均为国产分析纯； 10 buffer（ Mg2+ free）、 MgC12、 dNTP、 Taq 酶、 DL 2000 DNA Marker、引物 (CYTB、 COII)均购自上海捷瑞生物工程有限公司。 1.2.2 自配试剂 （ 1） 5M NaCl 溶
17、液： NaCl 73.1g 溶于 200ml 水中，定容至 250ml，高压蒸汽灭菌， 4保存； （ 2） 70%乙醇 溶液： 350ml 无水乙醇与 150ml 水混匀； （ 3） 0.5M EDTA 溶液： EDTA 146.12g 溶于 300ml 水中，加入少量 NaOH浓溶液，使之完全溶解，加少量浓盐酸调整 PH至 8.0，加水定容至 1000ml，分装成 500ml 后，高压蒸汽灭菌， 4保存； （ 4） 50 TAE 缓冲溶液： Tris 242g，冰乙酸溶液 57.1ml， 0.5M EDTA毕业论文 - （ PH=8.0） 100ml，加水定溶至 1000ml； （ 5） 1
18、0% SDS 溶液：电泳级 SDS 25g 溶于 200ml 水中（水浴加热至 68），加少量浓盐酸调整 PH 至 7.2，加水定溶至 250ml，高压蒸汽灭菌， 4保存； （ 6） 1M Tris-HCl 溶液： Tris 121.14g 溶解于 500ml 水中，加少量浓盐酸调整 PH 至 8.0，加水定溶至 1000ml； （ 7） TE 抽提缓冲液： 5ml 1M Tris-HCl 溶液， 10ml 0.5M EDTA 溶液，加水定溶至 500ml，高压蒸汽灭菌， 4保存； （ 8） TE溶模板： 5ml 1M Tris-HCl 溶液， 100ul 0.5M EDTA 溶液，加水定溶至
19、 500ml，高压蒸汽灭菌， 4保存； （ 9）蛋白酶 K（ 20mg/ml）： 20mg 可 溶性蛋白酶 K 加入到溶解缓冲液（ 1ml 50mM Tris-HCl PH=8.0，加 0.237mg 乙酸钙，终浓度 1.5mM）中，充分溶解混匀，用 PCR 管分装成每管 100ul， -20冷冻保存； （ 10）氯仿异戊醇（ 24:1）溶液： 4ml 异戊醇溶于 96ml 氯仿溶液中，混匀 4保存； （ 11） 1.5%的琼脂糖凝胶：琼脂糖 0.45g 放入锥形瓶中，加入 30ml 1TAE 缓冲溶液，置微波炉加热至完全溶解，取出混匀，则为 1.5%琼脂糖凝胶液。 1.2.3 琼脂糖凝胶板的
20、制备 1.5%的琼脂糖凝胶板：取洗净晾干的制 胶槽放置于一水平位置，并放好样品梳子，将冷却到 60左右的 1.5%琼脂糖凝胶液缓缓倒入制胶槽内，形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡），待胶凝固后取出梳子。 1.3 主要仪器与设备 锥形瓶：容量 250ml，中国医药（集团）上海化学试剂公司 烧杯：容量 100ml， 500ml， 1000ml，国药集团化学试剂有限公司 量筒：容量 50ml， 100ml， 250ml，中国医药（集团）上海化学试剂公司 广口瓶：容量 250ml， 500ml，国药集团化学试剂有限公司 移液器：容量 2.5ul、 10ul、 20ul、 100ul、 200ul、
21、1000ul，法国 Gilson公司 立式压力蒸汽灭菌器： YXQ-LS-50S11 型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 电热恒温鼓风干燥箱： GZX-9070MEB 型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 电热恒温水浴锅： HWS26 型，上海一恒科学仪器有限公司 电子天平： EL104 型，上海梅特勒 -托利多仪器有限公司 毕业论文 - 实验室 PH 计： FE20 型，上海梅特勒 -托利多仪器有限公司 美的微波炉： MM823ESJ-PA 型，广东美的微波炉制造有限公司 离心机： GL-166-II型，上海安亭科学仪器厂 双稳定电泳仪： DYY-8C型，北京市六一仪器厂 BIO-RAD 凝胶
22、成像仪： GDXI 型，美国伯乐 BIO-RAD 公司 PCR 仪： PTC-200 型，美国伯乐 BIO-RAD 公司 海尔冰箱（ 4、 -20）：海尔 BCD-539WF 型，对开门，中国海尔集团 上菱冰箱（ -70）：上菱 BCD-123 型，上海上菱电器制造有限公司 1.4 实验耗材 玻璃棒：购自江苏省泰兴市振科仪器厂 一次性 PE薄膜手套：购自上海市医用卫生材料厂 20l、 200l及 1000l Tip枪头：购自上海捷瑞生物工程有限公司 0.2ml、 1.5ml及 5ml Eppendorf管：购自美国 Axygen公司 1.5 实验方法 1.5.1 长蛸基因组 DNA的提取 基因
23、组总 DNA 的提取采用常规的“酚 -氯仿”抽提法 22,23。取保存于 -70冰箱中的大连长蛸样品的少量肌肉组织 100mg于 1.5ml离心管中，加入 475ul TE 抽提缓冲液，将样品肌肉组织用医用剪刀剪碎（尽量细），加入 25ul 10% SDS溶液，终浓度为 0.5%，混匀后加入 5ul 20mg/ml 蛋白酶 K至终浓度 50ug/ml，55水浴消化约 3h。水浴消化完全后取出冷却，加入 500ul 饱和酚（等体积），轻 摇 10 分钟， 12000 转 /分钟冷冻离心 10 分钟，用扩口吸头移出含 DNA 的上清液，重复上述步骤两次。加入等体积的饱和酚：氯仿（ 1:1），轻摇
24、10 分钟，12000 转 /分钟冷冻离心 10 分钟，用扩口吸头移出含 DNA 的上清液。加入等体积的氯仿异戊醇（ 24:1）溶液，轻摇 10 分钟， 12000 转 /分钟冷冻离心 10分钟，用扩口吸头小心吸出上层含 DNA 的水相。加入 1/25 体积的 5M NaCl溶液（终浓度为 0.1mol/L）和 2 倍体积的预冷的无水乙醇沉淀 DNA，上下颠倒数次，可见白色絮状 DNA， -20沉淀 30 分钟， 12000 转 /分钟冷冻离心 10分钟，弃上清液。用 70%乙醇溶液 300ml 清洗沉淀一次， 12000 转 /分钟冷冻离心 10 分钟，弃上清液。风干沉淀，加入 100ul
25、TE 溶模板（ PH=8.0）轻摇溶解，母液 4冰箱保存备用 24。 1.5.2 基因组 DNA的检测 提取后的 DNA用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，每一个 DNA样品取 5ul溶解的 DNA 母液和约 1ul 上样缓冲液混匀后小心上样，在另一加样孔加入 DL 毕业论文 - 2000 DNA Marker 3ul 作为 Marker，在双稳定电泳仪上电压保持 122V， 1TAE 缓冲溶液中电 泳分离 25分钟左右。电泳结束后，用 EB溶液染色 20 分钟左右，在美国伯乐 BIO-RAD 公司的 GDXI 型凝胶成像仪下检测所提 DNA 是否完整，估计 DNA 的浓度和大小。 1.5.
26、3 基因组线粒体基因的扩增 25 1.5.3.1 PCR扩增引物 本实验选用线粒体 DNA中的 CYTB和 COII基因片段为目的 DNA片段。基因片段扩增所选用的引物为曼氏无针乌贼的扩增引物 26，引物由上海捷瑞生物工程有限公司代为合成。 CYTB基因片段扩增所用引物的核苷酸序列为： CYTB r： 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3； CYTB f： 5-TAAACTTGAGGGTGACCAAAAAAT-3。 COII基因片段扩增所用引物的核苷酸序列为： COII r： 5-CCGGTCTGAACTCAGMTCAYGT-3； COII f： 5-CGCCTGTTTAH
27、YAAAAACAT-3。 1.5.3.2 PCR反应体系 PCR扩增反应在 美国伯乐 BIO-RAD公司的 PTC-200型 PCR仪上进行。 在 0.2ml PCR薄壁管内配制 50ul反应体系，依次加入以下组分： 表 1 50ul的反应体系 Tab.1 50ul reaction system 反应物 体积 /l 无菌 ddH20 35.4 10 buffer（ Mg2+ free） 5 25mM MgC12 4 10mM dNTP 1 r 引物 1 f 引物 1 模板 DNA 2 5u/ul Taq 酶 0.6 充分混匀后，稍加离心。 1.5.3.3 PCR反应程序 按下面的循环程序进行 PCR扩增反应： 94预变性 5分钟后，进行 40个循环的扩增，扩增程序为 94变性 1分钟， 51退火 1分钟， 72延伸 1分钟，全
