1、毕业论文 - 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 高产淀粉酶的海洋放线菌的鉴定及初步研究 学 院： 学生姓名： 专 业： 生物科学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 - 目录 摘要 . I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 3 1.1 实验材料 . 3 1.1.1 实验仪器 . 3 1.1.2 培养基 . 3 1.1.3 实验试剂 . 3 1.2 分离纯化 . 4 1.2.1 样品处理 . 4 1.2.2 分离培养 . 4 1.2.3 抑制剂 . 4 1.3 产淀粉酶 菌株筛选 . 4 1.3.1 菌株的定向筛选 . 4 1.3.2 Yoo 改良法测
2、酶活 . 5 1.3.3 紫外诱变选育 . 5 1.4 初步鉴定 . 5 1.4.1 形态观察 . 5 1.4.2 生理生化特性 . 5 2 结果分析 . 7 2.1 分离纯化结果 . 7 2.2 筛选结果 . 7 2.2.1 水解圈与酶活力 结果 . 7 2.2.2 紫外诱变后的酶活力 . 7 2.3 形态观察 . 7 2.3.1 外形观察 . 7 2.3.2 菌丝观察 . 8 2.4 生理生化特性 . 9 2.4.1 生理生化鉴定管 . 9 2.4.2 对不同 C 源的利用 . 9 2.4.3 对不同 N 源的利用 .10 2.4.4 不同 pH 下放线菌的生长 . 11 毕业论文 - 2
3、.5 菌株初步鉴定 . 11 小结 .12 参考文献 .13 致谢 .14 毕业论文 - 摘要 摘要 从舟山定海海滨公园的潮间带、滩涂中采集泥样和水样，分离到 42 株放线菌菌株。采用碘显色法初步筛选产淀粉酶的菌株，筛选到产淀粉酶的菌株 8 株，利用 Yoo 改良法测定其酶活力，筛选出 3 株酶活较大的菌株。复筛产酶活力强的菌株，筛选到 2 株酶活力较大的菌株，为菌株 A7 和 A46。利用紫外诱变的物理诱变法，对菌株 A7 和 A46 进行紫外诱变，筛选出酶活大的菌 株，以筛选出的菌株作为研究对象，对其进行形态观察及生理生化鉴定。通过 菌落特征、菌丝形态观察，生理生化鉴定， C 源利用及 N
4、 源利用和不同 pH 对其生长环境的影响，查阅伯杰细菌鉴定手册（第八版），初步鉴定菌株 A7、 A46 可能是链霉菌（ Streptomyces SP.A7 、 Streptomyces SP.A46）。 关键词 放线菌 淀粉酶 酶活力 诱变 鉴定 毕业论文 - Abstract Abstract： The mud samples and water samples in intertidal and shoals was collected from Zhoushan Dinghai Seaside Park , and isolated 42 strains of actinomycete
5、s. Preliminary screening of the strains of amylase production use odine color method , and screen 8 strains from the strains of amylase , then Yoo improved method is used for the determination of the enzyme activity , and screened three strong enzyme activity of strains. Screen the strains for the h
6、igh enzyme activity again , and screened two strong enzyme activity of strains , they are A7and A46 .Using of UV mutagenesis Physical Mutation method , A7 and A46 was mutated on this method . With these strains as the research object , observe their morphology and identify their Physiology and bioch
7、emistry . Through observing the colonies characteristics and the morphology of hyphae , authenticating the strainss Physiology and biochemistry , using the carbon source and the nitrogen source , and diverse pH affecting their growing environment , then consulting Berger bacteria appraisal manual (e
8、ighth edition) , and ascertain that the strains A7 and A46 may be Streptomyces SP.A7 and Streptomyces SP.A46 from the preliminary appraisal . Key words： actinomycetes ; amylase ; enzyme activity ; mutagenesis ; appraisal 毕业论文 - 引言 放线菌 （ Actinomyces） 是一类具有重要经济意义价值的微生物资源， 主要从泥土、泉水、土地、土壤及 海水附近等环境中分离得到，
9、与生命起源、系统进化关系极其密切 ,具有独特的基因类型、特殊的生理机制及特殊的代谢产物 ,为地球上的生命现象。 海洋特有的环境造就了海洋生物的多样性与独特性，低温、高压、高盐量使得海洋生物中一些酶、激素以及其他代谢产物有着极高的活性。而土壤是微生物生存的最佳场所，土壤中的微生物种类和数量都是很高的。因此，从沿海的潮间带和滩涂中筛选高产淀粉酶的菌株是一个有效的途径。 海洋放线菌是一类特殊的、具有重要价值的微生物。由于海洋环境的特殊性，海洋放线菌在生理性状和遗传性 上具有 特殊性 ， 因此海洋放线 菌 在 发现结构新颖的活性物质 的方向上具有很大的 潜力。据不完全统计， 50%以上新发现的海洋微生
10、物活性物质是由海洋放线菌这个庞大的分类群缩产生的 。 链霉菌 （ Streptomyces） ， 也称链丝菌 ， 好气，绝大部分腐生，其基质菌丝不断裂，气生菌丝分化成直 状 、弯曲 状 或螺旋状的 孢子 丝，成熟的孢子丝生成链状的分生孢子，故名链丝菌。菌落较小而致密，不易挑取，表面呈粉状、绒状，并有多种 颜色 。 小单胞菌（ Micromonospora） ， 基因菌丝发育良好，形成致密小菌落，直径约 3 毫米；菌丝纤细，直径 0.2 0.8 微米，无鞘 ， 有分枝，不断裂；一般无气生菌丝；孢子单个生在基内菌丝上， 时常在基丝表面形成褐黑色孢子层，孢子表面光滑、粗糙或有突起 ； 菌落黄橙或橙红
11、 ， 也有的为绛红、褐色或绿蓝等色 。 诺卡菌（ Nocardia） ，为 需氧革兰氏染色阳性杆菌。菌为多形态，有球状、杆状 和 丝状 ，菌体大小 0.6(3 4)微米 ， 无运动性，有些菌种呈弱抗酸性，专性需氧 ， 营养要求一般。在普通琼脂平板上培养 3 天后有可见菌落 ， 7 10 天后菌落凸起 ， 气生菌丝形成后 ， 表面呈绒毛状。不同种的菌落有黄、 橙、红或这些色素的混合色。 淀粉酶 (Amylase)是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称 ， 广泛存在于动植物和微生物中 。 淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据 ， 也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应
12、的依据 。 淀粉酶由于种类繁多、特点各异，广泛应用于燃料酒精、淀粉糖浆、传统酿造、食品加工、纺织退浆等行业，同时，在医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、 青贮饲料及微生态制剂等多种 领域中有应用。 微生物是淀粉酶最重要 的来源 ,所产的淀粉酶较动、植物来源的蛋白酶易于分离与纯化。在工业生产上，淀粉酶是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，微生物发酵是淀粉酶来源的主要途径。由于真菌，细菌产生的淀粉酶研究已经很广泛，而对放线菌产淀粉酶的研究相对较少，从舟山海滨公园的潮间带、滩涂中采样获得的泥样和水样中筛选出几株产淀粉酶的菌株，经紫外诱变后对其酶活力及生理生化特性进行了初步研究。 毕业论文 - 1
13、材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验仪器 LDZX-75KBS 立式压力蒸气灭菌锅 BCD-539WE 海尔冰箱 HT-CJ-1 超净工作台 BS110S 电子 天平 QY-1000A 移液器 P200 移液器 A 型双层铁皮电驴 PH050A 型干燥箱 THZ-C 恒温振荡器 LD5-2A 低速离心机 723N 可见分光光度计 JB-2 恒温磁力搅拌器 2XY86-1 手提紫外消毒器 SKY-100B 恒温培养振荡器 单列四孔 HH-S4 恒温水浴锅 ISO-GEW 型游标卡尺 非发酵细菌生化鉴定管（杭州微生物试剂有限公司） 1.1.2 培养基 高氏一号培养基：可溶性淀粉 20g，
14、 NaCl 0.5g， K2 HPO4 0.5g ， FeSO4 0.01g，MgSO47H2 O 0.5g， KNO3 1g， 琼脂 20g，陈海水（代替蒸馏水） 1000mL， pH7.27.4， 121灭菌 20min。 发酵培养基：黄豆粉 10g，玉米粉 10g，可溶性淀粉 5g， KH2PO41g， pH7.27.4，陈海水（代替蒸馏水） 1000mL， 121灭菌 20min。 1.1.3 实验试剂 卢氏碘液： 1g 碘， 2g 碘化钾， 300mL 水，先将碘化钾溶于蒸馏水中，待全部溶解后再加碘，振荡溶解 。 工作碘液（ 0.4M mol/L）： 0.013g 碘， 0.035g
15、 碘化钾， 250mL 水， 先将碘化钾溶于蒸馏水中，待全部溶解后再加碘，振荡溶解 。 毕业论文 - 1.2 分离 纯化 1.2.1 样品处理 从舟山定海海滨公园的潮间带、滩涂，用灭菌后的小铲子采集泥样和水样，置于采样瓶（已灭菌）中 4保存。 泥样：用无菌药勺称取 5g 海泥样本于 95mL 无菌水中，剧烈震荡，形成混悬液，用无菌水稀释到 10-2、 10-3、 10-4、 10-5。 水样：用无菌移液器移取 1mL 水样于 9mL 无菌水中，剧烈震荡混匀，用无菌水稀释到10-2、 10-3、 10-4、 10-5。 1.2.2 分离培养 稀释后样品分别用高氏一号培养基涂布培养，每个梯度做 3
16、 个重复平板， 27培养35d， 48h 后注意观察平板中菌落 的 生长情况，避免菌苔生成 而 影响分离取样。 3-5d 后观察平板中的菌落， 挑取 不同颜色、形状的菌落 再次 分离 培养， 27 培养 48h。48h 后 挑取单个菌落，重复划线，重复上述步骤 3-5 次，得到较纯 的 菌株，接种到试管斜面中，于 4 冰箱冷藏保种备用。 1.2.3 抑制剂 分离海洋放线菌一般都需要使用抑制剂 ， 本次实验采用重铬酸钾 (150mg/L)作为抑制剂， 既有利于放线菌的生长 ， 又能抑制真菌和细菌的生长。 1.3 产淀粉酶菌株筛选 1.3.1 菌株的定向筛选 将上述保存的放线菌菌株经活化后，无菌操
17、作接种于高氏一号培养基中， 27培养 35d后，先挑取生长的菌落保种，后向 培养基中倒入 1mL 卢氏碘液，观察水解圈情况。将相应的产生水解圈的菌株从保种的培养基中各取一环接入发酵培养基中，震荡培养（ 200r/min）35d。 1.3.2 Yoo 改良法测定酶活 取 5mL 0.5%可溶性淀粉， 30预热 10min。 加稀释液 0.5mL（对 A7、 A30、 A46 发酵液进行 5000r/min 离心 7min，取上清液稀释 3倍），反应 5min 后，用 5mL 0.1mol/LH2SO4 溶液终止反应。 取 0.5mL 反应液与 5ml 工作碘液 （ 0.4Mmol/L） 显色，在
18、分光光度计于 620nm 进行吸光度的测定 。 以 0.5mL 水代替 0.5mL 反应液为空白，以不加酶液加相同的水的管为对照管 ，测定酶活。 毕业论文 - 酶活力计算公式： 酶活力（ u/mL） =(R0-R)/R0 50 D 式中 D 为酶液稀释倍数， R0 为底物 +碘液的光吸收值， R 为反应液 +碘液的光吸收值， 50 为换算系数。 1.3.3 紫外诱变选育 经 Yoo 改良法测定酶活后，选取酶活较高的 A7、 A46 菌株于高氏一号液体培养基中培养 35d 后制成孢子悬浮液。稀释到合适浓度（ OD600 值为 0.5 0.15）。分别进行不同时间梯度（ 30s、 60s、 90s
19、、 1.5min、 2min）的紫外 诱变。将诱变后的菌株用无菌水稀释到 10-1、 10-2、 10-3 后，涂布到高氏一号培养基上， 27培养 35d 后，挑取生长的菌落保种，然后向培养基中倒入 1mL 卢氏碘液，观察水解圈情况，将相应的产生水解圈较大的菌株从保种的培养基中各取一环接入发酵培养基中，震荡培养（ 200r/min） 35d 后，用 Yoo 改良法测定酶活力。 1.4 初步鉴定 1.4.1 形态观察 将 A7、 A46 高产淀粉酶的 菌株用划线法划线在高氏一号培养基上， 将无菌盖玻片以一定的角度沿着接种线斜插入培养基中， 27 培养 35d 后，取出盖玻片，于 光学显微镜下进行
20、观察 。 1.4.2 生理生化特性 1.4.2.1 使用非发酵细菌生化鉴定管 乳糖胆盐发酵试验 ： 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内 ， 接种量分别为 10mL 、1mL、 0.1 mL，若接种量 1mL，用 双料乳糖胆盐发酵管 ，若接种量 1mL，则 用单料乳糖胆盐发酵管 。每一梯度 接种 3 管， 27 培养 24 h，如乳糖胆盐发酵管不产酸产气，则说明该样品为非发酵菌种。 对产淀粉酶的放线菌菌株进行乳糖发酵试验，检测其是否为发酵菌种，若是非发酵菌株，则可用非发酵细菌生化鉴定管对其进行生理生化鉴定。 1.4.2.2 检测放线菌对不同 C 源的利用 将可溶性淀粉用 D-果糖、 D-甘露 糖、
21、 D（ +）木糖、 -L-（ +） 鼠李糖、糊精 （ 玉米 ） 、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖代替，制备高氏一号培养基，将 A7、 A46 菌株划线于培养基中， 27培养 35d，观察放线菌的生长情况。 1.4.2.3 检测放线菌对不同 N 利用 将 KNO3 用牛肉浸膏、大豆蛋白胨、干酪素、胰蛋白胨、酵母浸膏、脱脂奶粉代替， 制备高氏一号培养基，将 A7、 A46 菌株划线于培养基中， 27培养 35d，观察放线菌的生长情况。 毕业论文 - 1.4.2.4 检测放线菌在不同 pH 下的生长情况 分别将高氏一号培养基的 pH 值调为 5、 6、 7、 8、 9， 27培养 35d，观察放线菌的生长情况。
