1、毕业论文 - 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 高产淀粉酶的海洋放线菌的选育 学 院： 学生姓名： 专 业： 生物科学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 - 目录 摘要 .I Abstract.II 1.引言 .1 2.材料与方法 .2 2.1 材料 .2 2.1.1 实验材料 .2 2.1.2 试剂 .2 2.1.3 仪器 .2 2.1.4 培养基 .2 2.2 实验方法 .2 2.2.1 样品处理和菌种分离 .2 2.2.2 菌种初筛 .3 2.2.3 菌种复筛 .3 2.2.4 菌株形态观察 .3 2.2.5 高产淀粉酶的放线菌的紫外、 DES复 合诱变选育 .3 2.
2、2.5.1 孢子液的制备 .3 2.2.5.2 紫外诱变处理 . 3 2.2.5.3 DES 诱变处理 .4 2.2.6 酶活测定 .4 2.2.8 诱变后 菌株形态观察 . 4 3 .结果 .4 3.1 产淀粉酶放线菌的 筛选 .4 3.2 诱变条件选择 .6 3.3 紫外诱变筛选结果 .7 3.4 DES 诱变筛选结果 .9 3.5 诱变菌株形态观察 .错误 !未定义书签。 小结 . 11 参考文献 . 13 致谢 . 16 毕业论文 - 摘要 摘要 从 舟山定海 海滨公园的潮间带、滩涂中采集泥样 、 水样， 初筛 分离到 42株放线菌菌株，并采用 碘显色法 筛选出产淀粉酶 的 菌株， 复
3、筛后挑选酶活较大菌株 进行 UV、 DES 诱变，并用 YOO 改良法测淀粉酶活性 。结果表明共筛选到产淀粉酶的放线菌菌株 8 株，取淀粉酶酶活较高的 3 株菌株 A46、 A7 和 A30 进行 物理和化学 复合诱变 。 其中 A7 经 诱变后产淀粉酶活 从 48.8U/mL 提 高到72.1U/mL， 本文的研究结果为舟山海域潮间带海洋放线菌研究提供参考。 关键词 海洋放线菌；紫外诱变；淀粉酶；筛选； DES 毕业论文 - Abstract Abstract： we collected mud sample and water sample from the intertidal zone
4、s and tidal flats of Zhoushan Seashore Park, , screened separation to 42 strains of actinomycetes early. And by using the iodine color test for screening the strains that can produced amylase.After rescreening,selected strains with large amylase activity ,and used the improved method of YOO to test
5、the amylase activity of the mutagenic strains with UV、 DES。 The results show that eight strains of amylase producer were selected in all.Pick the top three of the amylase activity of the actinomycetes,A7、 A30， A46， to treat with chemical and physical mutagenesis. amylase Treatment with mutagenesis t
6、he enzyme activity of strain A7 increased from 48.8 U/mL to 72.1 U/mL. The result of this paper offers a reference to the marine actinomycetes study of the intertidal zone in Zhoushan sea area. Key words： marine actinomycete; UVmutagenesis; amylase; screening; DES ； 毕业论文 - 1.引言 淀粉酶 (Amylase)是能催化淀粉水解
7、转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称，它广泛存在于动植物和微生物中。淀粉 (Starch)作为农业第一大产品，其原料深加工是粮食与食品加工中的重要组成部分。 按水解淀粉方式不同，把淀粉酶分为 -淀粉酶（ - amylase）、 -淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶四类，其中 -淀粉酶最为常用。 淀粉是发酵工业的主要原料 ,通过发酵可以生产出众多产品 ,如乙醇、甘油、有机酸、氨基酸、酶等 ,也可以生产高附加值的生物制剂和药品。通过对淀粉的 生化处理可以提高淀粉产品的附加值 ,这些都需要淀粉酶的参与。淀粉酶是最早用于工业化生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一， 已经广泛地应用于
8、食品、发酵、畜牧业生产、纺织、谷物加工、造纸、医药和临床分析、轻工业等领域 早在数前年前，人类就已利用高温与中温淀粉酶的作用从事酿酒、制饴糖等。现在有实用价值的酶一般来自动物、植物和微生物，其中工业上的酶大多来自微生物产生的酶。 由于海洋环境的特殊性，赋予生活在海洋中的放线菌在生理性状和遗传性的特殊性，因此海洋放线菌具有从中发现结构新颖的活性物质的潜力。 海洋放线菌主要包括链霉菌属、小单孢菌属以及红球菌、诺卡氏菌、游动放线菌等稀有属种， 它们是 具有重要 开发 价值的微生物。 海洋环境的特殊性造就了海洋放线菌独特的代谢方式和代谢产物。 据不完全统计， 50%以上新发现的海洋微生物活性物质是由海
9、洋放线菌这个庞大的分类群缩产生的，暗示了开发海洋放线菌的巨大潜力。 淀粉酶的巨大潜力使其在社会生活中的需求量日益增加，因此，如何获得高产量、高活性的淀粉酶显得至关重要 。近年来，人们不断通过用紫外线、热处理、超声波、离子注入等物理诱变和硫酸二乙酯（ DES）、甲基磺酸乙酯（ EMS）等化学诱变剂，以 期获得产高淀粉酶活性的放线菌。本文采用 UV和 DES对从舟山海域潮间带、滩涂筛选得到的产淀粉酶放线菌进行物理化学诱变，为扩大产淀粉酶菌株来源提供可能性， 为舟山海域潮间带海洋放线菌研究提供参考。毕业论文 - 2.材料与方法 2.1 材料 2.1.1 实验材料 采自舟山定海海滨公园滩涂、潮间带附近
10、的水样或土样 20 余份。 2.1.2 试剂 NaCl ， K2HPO4 ， FeSO4， MgSO47H2O， KNO3， K2HPO4，琼脂，陈海水 ，碘， 碘化钾，可溶性淀粉，黄豆粉，玉米粉， H2SO4 , 硫酸二乙酯（ DES）， 磷酸钾缓冲液， 重铬酸钾 ， 硫代硫酸钠 2.1.3 仪器 恒温培养箱 PH050A 型 电子天平 BS110S 型 冰箱 海尔 BCD-539WE 型 超净工作台 HT-CJ-1型 低速离心机 LD5-2A 型 电 子 恒温水浴锅 单列四孔 HH-S4型 立式压力蒸汽灭菌器 LDZX-75KBS 型 恒温振荡器 THZ-C 型 隔水式恒温培养箱 GNP-
11、9160 型 移液器 QY-1000A 型和 P200 型 可见分光光度计 723N 型 恒温磁力搅 拌器 JB-2 型 手提紫外消毒器 2XY86-1 双层铁皮电炉 A 型 游标卡尺 ISO-GEW 型 2.1.4 培养基 高氏一号海水培养基：可溶性淀粉 20g， NaCl 0.5g， FeSO4 0.01g， MgSO47H2O 0.5g， KNO3 1g， K2HPO4 0.5g，琼脂 20g，陈海水 1000mL；调节 pH7.2 7.4， 121灭菌 20min 玉米黄豆粉培养基：黄豆粉 10g，玉米粉 10g，可溶性淀粉 5g， KH2PO4 1g， 陈海水 1000mL，调节 P
12、H7.27.4， 121 灭菌 20min 2.2 实验方法 毕业论文 - 2.2.1 样品处理和菌种分离 用灭菌后的小铲子采集泥样或水样 ， 置于 灭菌的采样瓶中 。 为了排除陆地微生物，最好选择远离人类干扰的所谓 原始天然海域 作为研究对象 。 样品处理：用无菌药勺称取 5g 海泥样本于 95mL 无菌水中，剧烈振荡制成均匀的混悬液，最后稀释到 10-1-10-77 个梯 度。 后用高氏一号琼脂海水培养基进行分离培养， 分别取 10-510-610-7 这三个梯度涂布于高氏一号琼脂海水培养平板表面， 每个稀释度做 3 个重复平板，然后 25-27 培养 3-5d， 48h 以后应经常注意观
13、察平板中菌落生长情况，避免菌苔生成影响分离取样。 用灭菌环或灭菌牙签挑选菌落， 对不同颜色、形状的菌落进行划线分离。 初步分离的菌株 继续 25-27 培养 48h，继续重复划线，重复上述步骤 3-5次，基本可以得到较纯菌株 。 2.2.2 菌种初筛 将分离纯化后的放线菌分别点种于高氏一号海水琼脂培养基。每个培养皿点 4种菌，用记号笔标记菌种。 27下培养 5天，滴加卢氏碘液， 观察其透明圈的有无及大小 ，用游标卡尺测量淀粉透明圈和菌落的直径 12，以其比值做表。 2.2.3 菌种复筛 在初筛纯种菌中挑取 HC 比值较大的菌株，各取一环，接种于玉米黄豆粉液体培养基， 27， 200r/min
14、摇床培养 3-5天后用 Yoo 改良法测定酶活，酶活力较高者初步确定为进行下一步诱变选育的目标菌株。将复筛所得菌株接种于高氏一号斜面试管中，于 4冰箱保种。 2.2.4 菌株形态观察 将 复筛 株划线在高氏一号海水固体培养基上， 27 培养， 3-5d 后观察菌落形态。 采用插片法对 目标放线菌进行形态观察：先在营养琼脂平板上进行划线，再将灭菌好的盖玻片以一定的角度沿着接种线斜插入营养琼脂中，注意不要插到培养皿底部， 27 培养， 3-5d 后 取出，于光学显微镜下进行观察 菌丝形态 。 2.2.5 高产淀粉酶的放线菌的紫外、 DES 复合诱变选育 2.2.5.1 孢子液的制备 挑取纯化的斜面
15、培养物（目标菌株）一环接种于 50ml/250ml的高氏培养基中，25 180-200r/min 培养 5d-7d，离心 6000r/min， 10min 收集菌体，用无菌生理盐水洗涤 2 次，制成一定浓度的菌悬 液（ OD600=0.5 0.15）进行紫外诱变。每种菌做 2个。 2.2.5.2 紫外诱变处理 取一定量的菌悬液放入 6cm 培养皿中（培养皿中液体厚度为 2mm） ,30cm 垂直照射，并用磁力搅拌器进行搅拌，分别照射 30、 60、 90、 120s，将处理的菌液用无菌生理盐水进行梯度稀释分别稀释至 10-1， 10-2， 10-3浓度，分别取 0.1ml 在高氏一号琼脂培养基
16、上进行涂布，至少做 3个重复，同时对未经紫外处理的对照菌液也进行同样的梯度稀释后平板涂布，计算致死率，致死率 =（ 1诱变处理后每 0.1 mL 菌落数 /毕业论文 - 对照每 0.1 mL 菌落数） 100%，根据经验致死率在 70%-80%之间时，正突变率最高。涂布后的平板在暗处培养 3-5d 后观察，选取 HC 比值（透明圈直径 /菌落直径）较对照明显大的单菌落进行发酵（同时进行斜面保种）， 25 ， 200r/min，50ml/250ml装量，做 3 个平行，测其酶活。 2.2.5.3 DES 诱变处理 挑取经紫外诱变后的斜面保种突变菌株于液体高氏 1 号培养基， 50ml/250ml
17、 接种， 25， 180r/min 培养 5-7 天。 将处于对数生长期的菌液在室温下 5 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，收集菌体。用 10 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.0）洗涤 2 次，然后重悬于 pH 7.0 的磷酸缓冲液中，调整菌液浓度为 108 个 /mL（调整 OD600=0.5 左右即可）。移取 4 mL 菌液到 16 mL 磷酸钾缓冲溶液（ pH 7.0）中，加入 0.2 mL 硫酸二乙酯（ DES），分别振荡处理 20、 40、 60 min，最后加入 0.5 mL 25%硫代硫酸钠中止反应。将诱变处理20、 40、 60 min 的菌
18、液分别稀释为 10-1、 10-2、 10-3 三个稀释度，每种浓度做 3 个重复，取 0.1ml 平板涂布， 以未经化学诱变处理的出发菌为对照， 25 恒温培养箱中培养 5d。将培养好的平板取出，菌落计数，计算致死率。挑取 HC 比值大的单菌落进行发酵（同时斜面保种），做 3个平行重复，测其酶活。 2.2.6 酶活测定 本实验用 Yoo改良法测定酶活： 取 5ml 0.5%的可溶性淀粉溶液，在 30 水浴中预热 10min，然后加适当稀释的酶液 0.5ml（对 A7、 A18、 A27、 A28、 A30、 A46 发酵液进行 5000R/min 离心 7min，取上清液稀释 3 倍），反应
19、 5min 后，用5mL0.1mol/L 硫酸溶 液终止反应。取 0.5mL 反应液与 5ml 工作碘液显色，在分光光度计于 620nm 进行吸光度的测定，以 0.5mL 水代替 0.5mL 反应液为空白，以不加酶液加相同的水的管为对照管。酶活力计算公式： 酶活力（ U/mL） =(R0-R)/R0*50*D 式中 R0， R 表示对照的吸光度值， D 为酶稀释的倍数 酶活力单位定义：在 30 ， 5min 内水解 1mg 淀粉（ 0.5%淀粉）的酶量为一个单位。 2.2.7 诱变菌株形态观察 同样观察诱变后的菌株的菌落形态，并用插片法观察菌丝生长情况。分别比较诱变前后菌株的形 态差异。 3.
20、 结果 3.1 产淀粉酶放线菌的筛选 初筛菌株经过倾倒卢氏碘液部分观察到透明圈（见表 .1），分别测其透明圈直径（ H）和菌落直径（ C）的比值，共筛选出 8 株产淀粉酶的放线菌； 挑取 HC 比值较毕业论文 - 大 的菌株摇瓶发酵 5 天后测酶活，将酶活较高的 A7、 A30、 A46 这 3 株菌初步定为 待诱变菌，即出发菌。 表 1. 出发菌的 H/C 和初始酶活 Table 1. The value of Hc and amylase activity of the initial strains 菌株 透明圈直径 H(cm) 菌落直径 C(cm) HC 比值 初始酶活（ U/mL）
21、表 1 出发菌株的透明圈和菌落生长情况 Table 2. the area of clear zones and growth status of the initial strains a. 图为 A46 出发菌株， 27，点种培养5 天后碘显色法形成的透明圈。 b. 图为 A46 出发菌株在高氏一号平板上划线形成菌落，颜色较为单一，乳白色，表面干燥，绒状，高氏一号培养基上产红色色素，生长速度较快（ 2-4d）。 A7 1.636 0.438 3.74 48.8 A30 0.808 0.392 2.061 29.6 A46 0.618 0.156 3.96 37.9 毕业论文 - c. 图为
22、 A7 出发菌株， 27，点种培养 5天后碘显色法形成的透明圈。 d. 图为 A7 出发菌株在高氏一号平板上划线形成菌落。与 A46 相比，相同条件下生长速度快一天左右 (3-5d)，菌落乳白色，质地致密，易挑取，绒状，高氏一号培养基上不产色素。 e. 图为 A30 出发菌株， 27，点种培养5 天后碘显色法形成的透明圈。 f. 图为 A30 出发菌株在高氏一号平板上划线形成菌落，乳白色，粘着力强，难挑取，形态不规则。 3.2. 诱变条件选择 按实验方法，对出发菌株分别用紫外线和 DES 处理，得到致死率曲线图 3、图4。一般认为，用诱变处理菌株时，当致死率高于 80%时得到的突变株能满足筛选的需要。如果进一步提高剂量，导致致死率过高，则不利于获得正突变。
