1、毕业论文 - 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 基于 CO基因的我国海域 4 个长蛸群体的遗传变异研究 学 院： 学生姓名： 专 业： 生物科学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 - 目录 摘 要 . Abstract . IV 引 言 . 1 1 材料与方法 . 2 1.1实验材料 . 2 1.2实验药品与试剂 . 2 1.2.1 实验所用的基本试剂 . 2 1.2.2 自配试剂 . 2 1.2.3 琼脂糖凝胶板的制备 . 3 1.3 主要仪器与设备 . 3 1.4 实验耗材 . 4 1.5 实验方法 . 4 1.5.1 长蛸基因组 DNA的提取 . 4 1.5.2 基因组
2、 DNA的检测 . 5 1.5.3 基因组线粒体基因的扩增 25 . 5 1.5.4琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增产物 . 6 1.5.5 扩增产物的序列测定和数据分析 . 6 2 实验结果与分析 . 7 2.1 基因组 DNA 的提取结果 . 7 2.2基因组线粒体基因的扩增结果 . 7 2.3 长蛸群体遗传多样性分析 . 8 2.3.1 长蛸 COII基因片段的基本统计与分析 . 8 2.4 长蛸群体的遗传分化与基因流 . 10 2.5 长蛸群体的聚类分析和遗传距离 . 12 3 实验讨论 . 13 3.1 长蛸 DNA的提取和线粒体基因扩增 . 13 3.2 长蛸群体的遗传多样性分析 .
3、 13 3.3 研究展望 . 14 毕业论文 - 小 结 . 15 参考文献 . 16 致 谢 . 33 毕业论文 - 摘 要 采用 PCR 扩增技术对中国 4 个不同海域（山东青岛、浙江温州、浙江舟山、福建东山）的长蛸群体的 COII 基因片段进行了扩增和测序，获得了长度为 560bp 长度的同源序列，分析了不同海域群体内和群体间的遗传变异。结果表明， 89 个个体共有 28 个单倍型，其中青岛群体 8 个，舟山群体 7 个，温州群体 6 个，东山群体 7 个。通过序列比对，变异均匀地分布于序列各个区域，但密码子偏好不明显。总群体单倍型多样性指数（ H） 0.8840.018，核苷酸多样性指
4、数（ Pi） 0.106400.00656，平均核苷酸差异数（ K）57.348，显示出一定的遗传多样性。 采用 MEGA3.1 对 4 个海域的长蛸群体进行聚类分析，构建系统树，结果表明： 青岛、舟山 2 个群体由于遗传距离较近首先聚为一支，而与东山群体遗传关系较远，与温州群体亲缘关系最远而最后聚类。 Tajimas D 和 Fus FS检验 显示 温州群体可能经历过种群扩张，而其它 3 个群体可能未经历过历史扩张事件。我国海域长蛸的这种遗传结构的形成原因还有待于进一步证实。 通过本次研究，从线粒体 DNA 水平分析我国不同海域长蛸群体的遗传变异情况，期望为开展我国长蛸群 体的资源评价、物种
5、保护及分子标记育种提供基础资料。 关键词 ： 长蛸；线粒体基因 ； CO 基因；遗传变异 毕业论文 - Abstract Fragments of COII gene were amplified and sequenced.in Octopus variabilis samples from 4 our different sea areas in China (Qingdao, Wenzhou, Zhoushan, Fujian) A 560bp aligned sequence were obtained and analyzed to detect genetic variation
6、within and among the groups. The results showed that 89 individuals produce a total of 28 haplotypes, with eight in Qingdao group, seven in Zhoushan group, six in Wenzhou group, seven in Dongshan group. By sequence alignment, the variation is evenly distributed in the various regions of the sequence
7、, but the codon bias is not obvious. The total population haplotype diversity index (H) is 0.884 0.018, nucleotide diversity index (Pi) is 0.10640 .00656, the average number of nucleotide differences (K) is 57.348, showing a certain degree of genetic diversity. A phylogenetic tree among the 4 Octopu
8、s variabilis by adopting MEGA3.1 software showed that: the genetic distance among Qingdao and Zhoushan group was minimum. the genetic distance between those two and Dongshan or Wenzhou group are much big. Wenzhou groups may have experienced a population expansion, while the other three groups may no
9、t have experienced a historical expansion events. The phylogenetic tree reflects the genetic differences between the geographical distribution of these groups. Through this study, the level of mitochondrial DNA analysis of genetic variation in different waters Octopus variabilis groups expect to car
10、ry out the group of Chinas Octopus variabilis resource assessment, protection of species and molecular marker breeding genetic data. Key words ： Octopus variabilis; mitochondrial genes; COII gene; Genetic variation毕业论文 - 引 言 长蛸 (Octopus variabilis) 是我国沿海重要的海洋头足类，又名马蛸、长腿蛸、大蛸，属软体动物门（ Mollusca）头足 纲（ Ce
11、phalopada）蛸科（ Octopodidae）蛸属动物，分布于我国黄海、渤海、东海和南海海域。长蛸肉味鲜美，营养丰富，具有补气养血，收敛生肌的作用，经济价值高，是畅销国际国内市场的水产品，也一直是我国重要的海洋捕捞种类之一。但近年来，由于我国沿海头足类资源的大力开发，捕捞强度日益加大，其资源量也日趋衰退。为了更有效地保护和管理我国的长蛸资源，维持其可持续采捕，同时也为今后长蛸资源更合理的人工开发，有必要对其种群结构和遗传变异作深入的研究，从而为我国长蛸资源的保护和管理提供必要的指导。 目前关于长 蛸遗传多样性的研究资料还非常少，在国内外仅见于等位基因酶的遗传变异研究 9，鲜有从线粒体 D
12、NA 上研究长蛸的遗传多样性。线粒体 DNA(mtDNA)作为细胞中的相对独立的核外遗传物质，广泛的存在于生物体的各种组织细胞中，由于其具有分子量小、分子结构简单且稳定、母性遗传、一级结构进化速度快、突变率高、均一、无组织特异性等特征，易于分离纯化 10，重复性好，已成为研究动物起源进化，群体遗传分化及系统发育的理想研究材料 11，在渔业资源研究方面得到广泛应用 12。目前，随着 DNA 测序技术和分子信息学的快速发展 ，线粒体 DNA 作为一种优良的标记技术广泛的用于生物的遗传变异研究 13,14,15 。线粒体细胞色素氧化酶亚基 II (Cytochrome oxidase II, CO）
13、是 mtDNA 13 个蛋白质编码基因之一 ,该基因的产物是细胞色素氧化酶亚基 II,后者是细胞色素氧化酶的重要组成部分。与其他线粒体蛋白质编码基因相比 , CO基因的进化速率较快 ,常被用来研究亲缘关系较近的种、种下分类单元以及地理种群之间的关系 16（ 2） 。 本文利用 PCR 扩增产物直接测序的方法对来自山东 青岛、浙江温州、浙江舟山、福建东山 的 89 个个体的 COII 基因片段序列进行了测定和分析，从线粒体 DNA 水平分析我国不同海域长蛸群体的遗传变异情况，期望为开展长蛸群体的资源评价、物种保护及分子标记育种提供遗传学资料，同时与其他海域长蛸群体的序列进行了比较，为其种质资源的
14、保护、管理以及对物种的起源进化及长蛸群体结构和遗传分化的研究提供基础资料。 毕业论文 - 1 材料与方法 1.1实验材料 长蛸成体样本 89 尾，于 2008 年采自 4 个不同自然海域（青岛群体 21 尾、舟山群体 23 尾、温州群体 22 尾、东山群体 23 尾）， 全部野生。长 蛸规格体长大约在 15-27cm，体重约 100 克，健康状况良好。 经鉴定后冰镇活体空运回实验室， 取肌肉 3-5g立即冻存于 -70冰箱中备用。 1.2实验药品与试剂 1.2.1 实验所用的基本试剂 去离子水 ： 实验室自制 琼脂糖 ： 中国医药上海化学试剂公司 氯仿 ： 国药集团化学试剂有限公司 NaCl：
15、 国药集团化学试剂有限公司 浓盐酸 ： 国药集团化学试剂有限公司 无水 乙醇 ： 国药集团化学试剂有限公司 乙酸钙： 国药集团化学试剂有限公司 冰乙酸： 国药集团化学试剂有限公司 酚： 国药集团化学试剂有限公司 异戊醇： 国药集团化学试剂有限公司 蛋白酶 K： 宝生物工程（大连）有限公司 乙二胺四乙酸（ EDTA） ： 北京鼎国生物技术发展中心 三羟甲基氨基甲烷（ Tris） ： 国药集团化学试剂有限公司 十二烷基硫酸钠（ SDS） ： 宝生物工程（大连）有限公司 以上试剂均为国产分析纯； 10 buffer（ Mg2+ free）、 MgC12、 dNTP、 Taq 酶、 DL 2000 D
16、NA Marker、引物(COI、 16S rRNA)均购自上海捷瑞生物工程有限公司。 1.2.2 自配试剂 （ 1） 5M NaCl溶液： NaCl 73.1g 溶于 200ml水中，定容至 250ml，高压蒸汽灭菌，4保存； （ 2） 70%乙醇溶液： 350ml 无水乙醇与 150ml水混匀； 毕业论文 - （ 3） 0.5M EDTA 溶液： EDTA 146.12g 溶于 300ml 水中，加入少量 NaOH 浓溶液，使之完全溶解，加少量浓盐酸调整 PH 至 8.0，加水定容至 1000ml，分装成 500ml后，高压蒸汽灭菌， 4保存； （ 4） 50 TAE 缓冲溶液： Tris
17、 242g，冰乙酸溶液 57.1ml， 0.5M EDTA（ PH=8.0）100ml，加水定溶至 1000ml； （ 5） 10% SDS 溶液：电泳级 SDS 25g 溶于 200ml水中（水浴加热至 68），加少量浓盐酸调整 PH 至 7.2，加水定溶至 250ml，高压蒸汽灭菌， 4保存； （ 6） 1M Tris-HCl 溶液： Tris 121.14g 溶解于 500ml 水中，加少量浓盐酸调整 PH至 8.0，加水定溶至 1000ml； （ 7） TE 抽提缓冲液： 5ml 1M Tris-HCl溶液， 10ml 0.5M EDTA 溶液，加水定溶至500ml，高压蒸汽灭菌， 4
18、保存； （ 8） TE 溶模板： 5ml 1M Tris-HCl 溶液， 100ul 0.5M EDTA 溶液，加水定溶至500ml，高压蒸汽灭菌， 4保存； （ 9）蛋白酶 K（ 20mg/ml）： 20mg 可溶性蛋白酶 K 加入到溶解缓冲液（ 1ml 50mM Tris-HCl PH=8.0，加 0.237mg 乙酸钙，终浓度 1.5mM）中，充分溶解混匀，用PCR 管分装成每管 100ul， -20冷冻保存； （ 10）氯仿异戊醇（ 24:1）溶液： 4ml 异戊醇溶于 96ml 氯仿溶液中，混匀 4保存； （ 11） 1.5%的琼脂糖凝胶：琼脂糖 0.45g 放入锥形瓶中，加入 30
19、ml 1 TAE 缓冲溶液，置微波炉加热至完全溶解，取出混匀，则为 1.5%琼脂糖凝胶液。 1.2.3 琼脂糖凝胶板的制备 0.8%的琼脂糖凝胶板：取洗净晾干的制 胶槽放置于一水平位置，并放好样品梳子，将冷却到 60左右的 0.8%琼脂糖凝胶液缓缓倒入制胶槽内，形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡），待胶凝固后取出梳子。 1.3 主要仪器与设备 锥形瓶：容量 250ml，中国医药（集团）上海化学试剂公司 烧杯：容量 100ml， 500ml， 1000ml，国药集团化学试剂有限公司 量筒：容量 50ml， 100ml， 250ml，中国医药（集团）上海化学试剂公司 广口瓶：容量 250ml，
20、500ml，国药集团化学试剂有限公司 移液器：容量 2.5ul、 10ul、 20ul、 100ul、 200ul、 1000ul，法国 Gilson 公司 立式压力蒸汽灭菌器： YXQ-LS-50S11 型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 毕业论文 - 电热恒温鼓风干燥箱： GZX-9070MEB 型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 电热恒温水浴锅： HWS26 型，上海一恒科学仪器有限公司 电子天平： EL104 型，上海梅特勒 -托利多仪器有限公司 实验室 PH 计： FE20 型，上海梅特勒 -托利多仪器有限公司 美的微波炉： MM823ESJ-PA 型，广东美的微波炉制造有限公司 离
21、心机： GL-166-II 型，上海安亭科学仪器厂 双稳定电泳仪： DYY-8C 型，北京市六一仪器厂 BIO-RAD 凝胶成像仪： GDXI 型，美国伯乐 BIO-RAD 公司 PCR 仪： PTC-200 型，美国伯乐 BIO-RAD 公司 海尔冰箱（ 4、 -20）：海尔 BCD-539WF 型，对开门，中国海尔集团 上菱冰箱（ -70）：上菱 BCD-123 型，上海上菱电器制造有限公司 1.4 实验耗材 玻璃棒：购自江苏省泰兴市振科仪器厂 一次性 PE薄膜手套 ：购自 上海市医用卫生材料厂 20l、 200l及 1000l Tip枪头 ：购自上海捷瑞生物工程有限公司 0.2ml、 1
22、.5ml及 5ml Eppendorf管 ：购自美国 Axygen公司 1.5 实验方法 1.5.1 长蛸基因组 DNA 的提取 基因组总 DNA 的提取采用常规的“酚 -氯仿”抽提法 22,23。取保存于 -70冰箱中的长蛸样品的少量肌肉组织 100mg 于 1.5ml 离心管中，加入 475ul TE 抽提缓冲液，将样品肌肉组织用医用剪刀剪碎（尽量细），加入 25ul 10% SDS 溶液，终浓度为 0.5%，混匀后加入 5ul 20mg/ml 蛋白酶 K 至终浓度 50ug/ml， 55水浴消化约 4h。水浴消化完全后取出冷却，加入 500ul 饱和酚（等体积），轻摇 8 分钟 ， 12
23、000 转 /分钟冷冻离心 10分钟，用扩口吸头移出含 DNA 的上清液，重复上述步骤两次。加入等体积的饱和酚：氯仿（ 1:1），轻摇 10 分钟， 12000 转 /分钟冷冻离心 10 分钟，用扩口吸头移出含 DNA的上清液。加入等体积的氯仿异戊醇（ 24:1）溶液，轻摇 10 分钟， 12000 转 /分钟冷冻离心 10 分钟，用扩口吸头小心吸出上层含 DNA的水相。加入 1/25 体积的 5M NaCl 溶液（终浓度为 0.1mol/L）和 2 倍体积的预冷的无水乙醇沉淀 DNA，上下颠倒数次，可见白色絮状 DNA， -20沉淀 30 分钟， 12000 转 /分钟冷 冻离心 10 分钟
24、，弃上清液。用70%乙醇溶液 300ml 清洗沉淀一次， 12000 转 /分钟冷冻离心 10 分钟，弃上清液。风干毕业论文 - 沉淀，加入 100ul TE 溶模板（ PH=8.0）轻摇溶解，母液 4冰箱保存备用 24。 1.5.2 基因组 DNA 的检测 提取后的 DNA 用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，每一个 DNA 样品取 5ul 溶解的 DNA 母液和约 1ul 上样缓冲液混匀后小心上样，在另一加样孔加入 DL 2000 DNA Marker 3ul 作为 Marker，在双稳定电泳仪上电压保持 122V， 1 TAE 缓冲溶液中电泳分离 25 分钟 左右。电泳结束后，用 EB
25、 溶液染色 20 分钟左右，在美国伯乐 BIO-RAD公司的 GDXI 型凝胶成像仪下检测所提 DNA 是否完整，估计 DNA 的浓度和大小。 1.5.3 基因组线粒体基因的扩增 25 （ 1） PCR扩增引物 本实验选用线粒体 DNA中的 COII基因片段为目的 DNA片段。基因片段扩增所选用的引物为曼氏无针乌贼的扩增引物 26，引物由上海捷瑞生物工程有限公司代为合成。 COII基因片段扩增所用引物的核苷酸序列为： COII r： 5-GTATAAATGAGTGRTTTGCWCCAC-3； COII f： 5-TGACCCAATGAGGACAATTAGG-3。 （ 2） PCR反应体系 PC
26、R扩增反应在 美国伯乐 BIO-RAD公司的 PTC-200型 PCR仪上进行。 在 0.2ml PCR薄壁管内配制 50ul反应体系，依次加入以下组分： 表 1 50ul的反应体系 Tab.1 50ul reaction system 反应物 体积 /l 无菌 ddH20 35.4 10 buffer（ Mg2+ free） 5 25mM MgC12 4 10mM dNTP 1 r 引物 1 f 引物 1 模板 DNA 2 5u/ul Taq 酶 0.6 充分混匀后，稍加离心。 （ 3） PCR反应程序 按下面的循环程序进行 PCR扩增反应： 94预变性 5分钟后，进行 40个循环的扩增，扩增程序为 94变性 1分钟， 51退火 1分钟， 72延伸 1分钟，全部循环完成后
