1、毕业论文 - 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 基于 Cytb 基因的我国海域 4 个长蛸群体的遗传变异研究 学 院： 学生姓名： 专 业： 生物科学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 - 目录 摘要 .错误 !未定义书签。 Abstract . II 引言 . 错误 !未定义书签。 1 材料与方法 . 2 1.1 实验 材料 . 2 1. 2 实验药品与试剂 . 2 1.2.1 实验所用基本试剂 . 2 1.2.2 试剂配置 . 2 1.2.3 琼脂糖凝胶板的制备 . 3 1. 3 主要仪器与设备 . 3 1. 4 实验耗材 .4 1. 5 实验方法 . 4 1.5.1 D
2、NA 的提取 . 4 1.5.2 基因组 DNA 的检测 .5 1.5.3 Cytb 基因组的扩增与测序 .5 1.5.4 数据分析 .5 2 实验结果与分析 . 6 2.1 CYTB基因的序列组成和变异信息 . 6 2.2 长蛸群体的遗传多样性分析 . 6 2. 3 长蛸群体的遗传分化与基因流 .错误 !未定义书签。 2. 4 分子系统分析 . 7 3 讨论 . 8 3.1 线粒体 cytb引物扩增的通用性 . 9 3.2 长蛸线粒体 cytb 基因片段的序列特征 . 9 3.3 长蛸的遗传多样性水平 .9 论 结 .11 参考文献 . 12 致 谢 . 42 毕业论文 - 基于 Cytb
3、基因的 我国海域 4 个长蛸群体的遗传变异研究 摘要 ： 为探讨我国长蛸野生群体的遗传多样性水平和种质资源现状，为资源可持续利用和资源保护提供理论研究基础，本研究采用 PCR 扩增技术对我国 4 个海域的长蛸野生群体（山东青岛、浙江舟山、浙江温州、福建 东山 ）共 90 个样本的线粒体 Cytb 基因进行扩增和测序，对四个野生群体进行群体内和群体间的遗传变异分析，探讨其遗传变异指数等。经过扩增后测序，每个样本获得了 234bp 长度的线粒体 Cytb 基因片段序列，在 234bp 长度的线粒体 Cytb 基因片段中共检测到 140 个多态位点， 16 个单倍型，单倍型多样性指数 H 达 0.8
4、700.015，核苷酸多样性指数 Pi 达 0.112440.00999，平均核苷酸多样性指数 K 达 24.400，分子系统树分析表明每个群体仍然保持了各自的遗传特性，保持了一定的遗传隔离。 遗传参数数据表明，在目前我国沿海对长蛸野生群体捕获量较大的情况下，仍然保持了一定程度上的遗传多样性，说明仍然保持了相对较高的遗传多样性，但是相比于其他物种而言，其种质资源现状也不容乐观，亟需要进行将 资源保护作为重要的关注内容，通过本次研究，从线粒体 DNA 水平分析我国长蛸群体的遗传变异情况，期望为 今后 开展长蛸群体的资源评价、物种保护及分子标记育种 等 提供基础资料。 关键词： 长蛸 ； 线粒体
5、DNA； Cytb 基因 ； 遗传变异 毕业论 文 - Abstract Genetic variation among 4 Octopus variabilis populations along the coast of China based on mitochondrial cytb gene Abstract Studies on genetic variation in marine organisms are an important component of successful and sustainable management of marine fishery reso
6、urces. Fragments from mitochondrial cytb genes of Octopus variabilis sampled from four populations (Qingdao， Zhoushan， Wenzhou， Dongshan) were amplified and sequenced. 234bp sequences of cytb gene fragments were obtained. Sixteen haplotypes were identified from all sequenced mtDNA fragments; Cytb se
7、quence haplotype diversity index was observed to be 0.87， nucleotide diversity index was 0.1124， the average number of nucleotide differences was 24.4; These findings in the aspect of genetic variation of Octopus variabilis will contribute to better exploitment and refined management of this preciou
8、s cephalopod resources along the coast of China in future. Key words Octopus variabilis; mitochondrial DNA; cytb gene; Genetic variation; Genetic polymorphism 毕业论文 - 引 言 近年来， 遗传变异研究为海洋生物种群结构、 区域分布 环境适应等基础生物学的了解提供基本信息 1-3 ，而且为海洋生物资源的开发、 利用、 管理提供 了可行性 指导 4。种群遗传变异研究是当前海洋生物学研究的热点 5。随着国际传统海洋生物资源的衰退 ， 海洋生
9、物 遗传变异及多样性的研究再一次引起国际社会的广泛关注，以形态、染色体、蛋白质及 DNA为基础的种群遗传变异研究在海洋鱼类、贝类及虾蟹类 6中已广泛开展。海洋头足类是至今尚未充分开发的少数几种渔业资源之一 7。近几年来随着国际海洋头足类研究和开发的兴起，至今为止已在乌贼 8， 9 、章鱼 10， 11、鱿鱼 12， 13 及鹦鹉螺14等主要头足类种类中得到广泛研究 。 但长期的研究表明，头足类是一类遗传变异相对较低 的海洋生物类群 15，极低的遗传多样性和高度的遗传均质性已在众多海洋头足类中得以验证 15， 16。随着研究的不断深入，特别是高新技术手段在海洋头足类遗传变异中的广泛运用，丰富的遗
10、传变异和复杂的种群遗传结构已 陆续 在海洋头足类种群中陆续得以证实 17-18。 长蛸 (Octopus variabilis)是我国沿海重要的海洋头足类，又名马蛸、长腿蛸、大蛸，属软体动物门（ Mollusca）头足纲（ Cephalopada）蛸科（ Octopodidae）蛸属动物，分布于我国黄海、渤海、东海和南海海域。其产品肉味鲜美，营养丰富，具有补气养血，收敛生肌的作用，经济价值高，是畅销国际国内市场的水产品，也一 直是我国重要的海洋捕捞种类之一。但近年来，由于我国沿海头足类资源的大力开发，捕捞强度日益加大，其资源量也日趋衰退。为了更有效地保护和管理我国的长蛸资源，维持其可持续采捕，
11、同时也为今后长蛸资源更合理的人工开发，也有必要对其种群结构和遗传变异作深入的研究，从而为我国长蛸资源的保护和管理提供必要的指导。 本文 采用 PCR扩增 技术对 4个地理群体的长蛸资源的遗传变异和种群结构进行研究。希望从线粒体 DNA的 cytb基因序列分析入手， 检测我国长蛸群体中常规形态学无法反映的微细遗传差异和遗传结构，以期为我国长蛸种质资源的合 理开发、管理和保护提供理论依据。 毕业论文 - 1.材料与方法 1.1实验材料 长蛸取自我国的渤海及东海沿海海域，采集的点分别是山东省青岛，浙江省舟山、温州，福建省 东山 海域。长蛸规格体长一般在 15-27cm，体重约 100 克，健康状况良
12、好。共采集样本 90 头，样本活体解剖后取新鲜肌肉样品放入 95%酒精固定液中保存，带回实验室备用。 1.2实验药品与试剂 1.2.1 实验所用的基本试剂 去离子水：实验室自制 氯仿：国药集团化学试剂有限公司 琼脂糖：中国医药上海化学试剂公司 异戊醇：国药集团化学试剂有限公司 NaCl： 国药集团化学试剂有限公司 浓盐酸：国药集团化学试剂有限公司 无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司 冰乙酸：国药集团化学试剂有限公司 酚：国药集团化学试剂有限公司 乙酸钙：国药集团化学试剂有限公司 蛋白酶 K：宝生物工程（大连）有限公司 三羟甲基氨基甲烷（ Tris）：国药集团化学试剂有限公司 乙二胺四乙酸（ E
13、DTA）：北京鼎国生物技术发展中心 十二烷基硫酸钠（ SDS）：宝生物工程（大连）有限公司 以上试剂均为国产分析纯； 10buffer（ Mg2+ free）、引物 (COI、 16S rRNA)、 dNTP、 MgC12、 Taq 酶、 DL 2000 DNA Marker 均购自上海捷瑞生物工程有限公司。 1.2.2试剂配置 （ 1） 5M NaCl溶液： NaCl 73.1g 溶于 200ml水中，定容至 250ml，高压蒸汽灭菌，4 保存； 毕业论文 - （ 2） 0.5M EDTA 溶液： EDTA 146.12g 溶于 300ml水中，加入少量 NaOH 浓溶液，使之完全溶解，加少
14、量浓盐酸调整 PH 至 8.0，加水定容至 1000ml，分装成 500ml后，高压蒸汽灭菌， 4 保存； （ 3） 70%乙醇溶液： 350ml无水乙醇与 150ml水混匀； （ 4） 10% SDS 溶液：电泳级 SDS 25g 溶于 200ml水中（水浴加热至 68 ），加少量浓盐酸调整 PH 至 7.2，加水定溶至 250ml，高压蒸汽灭菌， 4 保存； （ 5） 50TAE 缓冲溶液： Tris 242g，冰乙酸溶液 57.1ml， 0.5M EDTA（ PH=8.0）100ml，加水定溶至 1000ml； （ 6） TE 溶模板： 5ml 1M Tris-HCl溶液， 100ul
15、0.5M EDTA 溶液，加水定溶至500ml，高压蒸汽灭菌， 4 保存； （ 7） 1M Tris-HCl溶液： Tris 121.14g 溶解于 500ml水中 ，加少量浓盐酸调整 PH至 8.0，加水定溶至 1000ml； （ 8） TE 抽提缓冲液： 5ml 1M Tris-HCl溶液， 10ml 0.5M EDTA 溶液，加水定溶至500ml，高压蒸汽灭菌， 4 保存； （ 9）氯仿异戊醇（ 24:1）溶液： 4ml异戊醇溶于 96ml氯仿溶液中，混匀 4 保存； （ 10）蛋白酶 K（ 20mg/ml）： 20mg 可溶性蛋白酶 K 加入到溶解缓冲液（ 1ml 50mM Tris-
16、HCl PH=8.0，加 0.237mg 乙酸钙，终浓度 1.5mM）中，充分溶解混匀，用PCR 管分装成每管 100ul， -20 冷冻保存； （ 11） 1.5%的琼脂糖凝胶：琼脂糖 0.45g 放入锥形瓶中，加入 30ml 1TAE 缓冲溶液，置微波炉加热至完全溶解，取出混匀，则为 1.5%琼脂糖凝胶液。 1.2.3 琼脂糖凝胶板的制备 1.5%的琼脂糖凝胶板：取洗净晾干的制胶槽放置于一水平位置，并放好样品梳子，将冷却到 60 左右的 1.5%琼脂糖凝胶液缓缓倒入制胶槽内，形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡），待胶凝固后取出梳子。 1.3 主要仪器与设备 烧杯：容量 100ml， 50
17、0ml， 1000ml，国药集团化学试剂有限公司 量筒：容量 50ml， 100ml， 250ml，中国医药（集团）上海化学试剂公司 毕业论文 - 锥形瓶：容量 250ml，中国医药（集团）上海化学试剂公司 移液器：容量 2.5ul、 10ul、 20ul、 100ul、 200ul、 1000ul，法国 Gilson 公司 广口瓶：容量 250ml， 500ml，国药集团化学试剂有限公司 电热恒温水浴锅： HWS26 型，上海一恒科学仪器有限公司 立式压力蒸汽灭菌器： YXQ-LS-50S11 型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 电热恒温鼓风干燥箱： GZX-9070MEB 型，上海博迅实业
18、有限公司医疗设备厂 电子天 平： EL104 型，上海梅特勒 -托利多仪器有限公司 双稳定电泳仪： DYY-8C 型，北京市六一仪器厂 实验室 PH 计： FE20 型，上海梅特勒 -托利多仪器有限公司 BIO-RAD 凝胶成像仪： GDXI 型，美国伯乐 BIO-RAD 公司 离心机： GL-166-II 型，上海安亭科学仪器厂 上菱冰箱（ -70 ）：上菱 BCD-123 型，上海上菱电器制造有限公司 PCR 仪： PTC-200 型，美国伯乐 BIO-RAD 公司 美的微波炉： MM823ESJ-PA 型，广东美的微波炉制造有限公司 海尔冰箱（ 4 、 -20 ）：海尔 BCD-539W
19、F 型，对开门，中国海尔集团 1.4 实验耗材 玻璃棒：购自江苏省泰兴市振科仪器厂 一次性 PE薄膜手套：购自上海市医用卫生材料厂 20l、 200l及 1000l Tip枪头：购自上海捷瑞生物工程有限公司 0.2ml、 1.5ml及 5ml Eppendorf管：购自美国 Axygen公司 1.5 实验方法 1.5.1 DNA 的提取 1）取肌肉约 0.1 克，加入 500L STE（ 100mM NaCl； 10mM Tris-Cl， pH8.0； 1mM EDTA， pH8.0）裂解缓冲液，剪碎，再加入 50L SDS（ 10%），以及 5L蛋白酶 K（ 20mg/mL）， 56 处理
20、3-4h，直到裂解液澄清。 2）加入等体积饱和酚（ 250L）、氯仿 /异戊醇（ 24:1）（ 250L），轻轻晃动 20min，12000 rpm 离心 10min。 3）取上清液，重复一次步骤 2，直至水相和有机相之间无蛋白层为止。 4）取上清液，加入等体积氯仿 /异戊醇，轻轻晃动 20min， 12000 rpm 离心 10min。 毕业论文 - 5）取上清液，加入 1/25 体积的 NaCl（ 5M），加 2V 冰冻的无水乙醇，缓慢摇匀，放置在 -20 冰箱中冻大约 30 分钟， 12000 rpm离心 10 分钟。将核酸沉淀于管底。 6）弃上清， 70%乙醇（ 1mL）洗涤沉淀 2
21、次。 7）自然干燥直到无水乙醇全部挥发。加入一定量（ 100L）的无菌超纯水和 0.5L RNase A（ 10mg/mL）， 4 过夜 直到 DNA 全部溶解 1.5.2 基因组 DNA的检测 提取后的 DNA 用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，每一个 DNA 样品取 5ul 溶解的 DNA 母液和约 1ul 上样缓冲液混匀后小心上样，在另一加样孔加入 DL 2000 DNA Marker 3ul 作为 Marker，在双稳定电泳仪上电压保持 122V， 1TAE 缓冲溶液中电泳分离 25 分钟左右。电泳结束后，用 EB 溶液染色 20 分钟左右，在美国伯乐 BIO-RAD 公司的 GD
22、XI 型凝胶成像仪下检测所提 DNA 是否完整，估计 DNA 的浓度和大小。 1.5.3.CYTB基因扩增和测序 CYTB 序列的扩增具体方法为：扩增引物 CYTB-F: 5-CGCCTCAAAGTAGCATTATCAACAG-3;CYTB-R:5-GTTATATTCATGC TAATGGNGCATC-3；序列扩增采用 50L反应体系，其中含模板 DNA 1L，含 10缓冲液 5L， 25mmol/L MgCl2 4L，取 2.5mmol/L dNTPs 4ml ，及 0.6L U Taq 酶。 PCR反应程序 :94 预变性 5 min 后， 94 变性 1 min ， 45 退火 1min
23、 ， 72 延伸 1min，共 45 个循环，最后 72 延伸 5min。所得 PCR 产物在 1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，凝胶成像系统拍照观察。扩增产物送往上海 Invitrogen 公司进行纯化并测序。 1.5.4.数据分析 所得序列采用 Clustal w1.83 软件进行编辑、排序和校对，采用 DNAsp4.10 软 件对多态位点数、单倍型数、核苷酸多样性（ P）、单倍型多样性 (H)、平均核苷酸差异数 (K)等遗传多样性参数进行计算 ;采用 Mega 3.1 软件进行遗传距离计算和聚类分析，系统树采用 UPGMA 模型进行构建， 并采用 bootstrap(重复次数为 1000
24、)检验聚类树各分支置信度 ;此外，用 Arlequin3101 软件估算遗传变异在群体内和群体间的分布 (AMOVA 法 )，采用 Tajima 的 D 检验和 Fu 的 FS 检验来检测中性假说是否成立， Tajima 的 D 和 Fu 的FS 中性检验结果如为负值并且显著偏离中性，则可能是由于群体扩张 引起的。毕业论文 - 2 实验结果与分析 2.1 CYTB基因的序列组成和变异信息 对 4 个长蛸群体共 90 个个体的 CYTB 序列进行测定，经 clustal w1.83 软件编辑和比对后，获得了长度为 234bp 长度的同源序列，经 Mega 3.1 软件分析，该序列的 T、C、 A
25、、 G 碱基含量分别为 26.5%、 21.5%、 43.8%和 8.2%。 A+T 含量（ 70.3%）大大高于 G+C（ 29.3%）含量，符合一般头足类 CYTB 基因的序列特点， DNAsp4.10 软件分析显示， 90 个个体共检测到 140 个变异位点，占分析位点总数的 59.4%，其中 单突变位点（ Singleton varible sites） 75 个，简约信息位点 (Parsimony informative sites) 65 个；变异均匀地分布于序列各个区域，但没有明显的密码子偏好，变异均匀的分布于编码密码子的第 1 位、第 2 位和第 3 位上。 2.2长蛸群体的遗
26、传多样性分析 用 DNAsp4.10 软件对各 长 蛸群体的遗传变异参数进行统计，结果如表 1 所示。 90个个体共有 16 个单倍型，其中青岛群体 3 个，舟山群体 5 个，温州群体 5 个， 东山 群体 3 个；总群体单倍型多样性指数（ H） 0.870.015，核苷酸多 样性指数（ Pi）0.112440.00999，平均核苷酸差异数（ K） 24.400，显示出一定的遗传多样性。对 4 个群体的遗传变异参数进行比较， 4 个群体的遗传多样性总体呈现温州变异相对较高，其中温州群体单倍型多样性指数（ H） 0.3380.128 ，核苷酸多样性指数（ Pi）0.079230.04109，平均核苷酸差异数（ K） 17.827，呈现出从北向南变异相对较低的趋势（表 2.2）。 表 2.2长蛸种群的遗传变异参数统计 变异参数 青岛群体 舟山群体 温州群体 福建群体 样本个数 23 22 22 23 单 倍型数（ Nhap） 3 5 5 3 单倍型多样性指数（ H） 0.6520.065 0.4030.125 0.3380.128 0.4660.094 核苷酸多样性（ Pi) 0.003220.00049 0.001880.00065 0.0792320.04109 0.002090.00048 平均核苷酸差异数（ K） 0.743 0.437 17.827 0.490
