1、毕业论文 - 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 酵母菌 PY-1 的发酵条件研究 学 院： 学生姓名： 专 业： 生物科学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 - 目 录 摘 要 . Abstract . 1 前言 .1 2 材料与方法 .3 2.1 菌种 .3 2.2 培养基 .3 2.3 主要试剂与设备 .3 2.3.1 主要试剂 . 3 2.3.2 设备 . 3 2.4 方法 .4 2.4.1 菌种扩大培养 . 4 2.4.2 蛋白的表达 . 4 2.4.3 制备平板培养基 . 4 2.4.4 发酵液的制备 . 4 2.4.5 抑菌活性测定 . 4 2.4.6 发酵单因素
2、试验 . 4 2.4.7 正交试验 . 5 3 结果与分析 .6 3.1 发酵单因素试验 .6 3.1.1 不同温度下的抑菌活性 . 6 3.1.2 不同培养时间下的抑菌活性 . 7 3.1.3 不同接种量下的抑菌活性 . 6 3.1.4 不同 pH 值下的抑菌活性 . 8 3.2 发酵正交试验 .9 4 讨论 .16 5 小结 .17 参考文献 .18 致谢 .20 毕业论文 - 摘 要 摘要 ： 为了探索能够抑制溶藻弧菌的菌株，从实验室保藏的菌种筛选到一株对溶藻弧菌有抑制作用的酵母菌 PY-1，以该菌作为出发菌株进行发酵条件研究。通过单因素试验研究该菌株的培养条件（接种量、 pH 值、培养
3、温度、培养时间）。并从单因素试验中选取四个因素的合适水平进行四因素三水平的正交试验，以抑菌圈直径为指标，从中得到菌株 PY-1 的摇床培养的最佳 条件为：初始 pH 8.0，接种量为 1%，在 25 下培养 3d。结果表明：在此条件下发酵液产生的抑菌圈最大，抑菌效果最佳。 关键词 ： 发酵条件；酵母菌 PY-1；抑菌 毕业论文 - Abstract Yeast PY-1 the conditions of fermentation of research Abstract In order to explore the algae which can inhibit Vibrio algino
4、lyticus, the bacteria selecting from laboratory preservation to dissolve a strain on the algae have inhibited vibrio yeast cells PY-1, with the bacteria strains of the fermented conditions as research. By single factor experiment study of the fungus culture conditions (quantity, pH value, culture te
5、mperature, cultured time). And from the single factor experiment selection in four factors for the four factors of the appropriate level three levels of orthogonal experiment, with antibacterial circle diameter as index, getting PY-1 strains the best conditions of wave bed raise for: initial pH 8.0,
6、 inoculation of 1%, and in 250 r/min, 25 training 3d. The results show under these conditions which fermented liquid the antibacterial circle have the largest, antibacterial effect is the best. Keywords Fermentation conditions; Yeast PY-1; antibacterial 毕业论文 - 1 前言 溶 藻弧菌 (Vibrio alginolyticus) 属于弧菌科
7、 (Vibrionaceae) ，弧菌属 (Vibrio) ，革兰氏阴性短杆菌，无芽孢、荚膜，单独存在或尾端相连成 “ C” 或 “ S” 形，为嗜盐嗜温性、兼性厌氧海生弧菌 ,适宜温度 17 35 1。 溶藻弧菌广泛分布于世界各地海水及河口处 2，并且数量居海水类弧菌之首 3，但其为嗜温菌，从夏季到冬季，由赤道向两极随着温度的降低其数量 也明显减少 4,5。另外，溶藻弧菌也大量分布在海洋动物中 6，如意大利亚德里亚海海域采集的紫贻贝 (Mytilus galloprovincialis)，其中分离出的溶藻弧菌占弧菌总数的 1/3 左右。 溶藻弧菌为海洋中正常菌群之一 ， 存在于多种海洋动物中
8、 ， 是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌。溶藻弧菌为嗜温菌 ， 其对养殖动物的致病性多发生在夏季 7， 在水温 25 32 下容易流行 8， 另外动物体免疫机能下降或环境恶化时也容易发生 ， 如台湾一些学者研究了虾在氨氮 (1.10 21.60mg/L)9、亚硝氮 (1.1221.40mg/L)10、 Cu2+ (1 20mg/L)11胁迫下对溶藻弧菌的敏感情况 ， 结果表明虾的免疫力降低、死亡率升高。此外溶藻弧菌对人的致病性也有大量报道 ， 可引起人食物中毒 12、耳炎 13等等。 溶藻弧菌对养殖业造成的危害，严重影响了养殖户的收入，因此如何有效的控制溶藻弧菌已经十分迫切。国外对溶藻弧菌
9、的研究很多，并采取多种方法防治。目前国内已经有人发现利用乳酸杆菌等可以起到对溶藻弧菌有抑制作用。 王军等 14人在大黄鱼 (Pseudosciaena crocea) 病原弧菌的拮抗 放线菌筛选和人工诱变 基础 上， 选择 出对 溶藻 弧菌 (Vibrio alginolyticus) 和副 溶血 弧菌 (V. parahaemolyticus) 同时具有较强拮抗作用的 4 株放线菌。采用琼脂块法测定 4 株放线菌的抗菌谱，并检测 4 株放线菌分别在固体和液体培养液中的拮抗作用。结果表明： 4 株放线菌的抗菌谱均较窄，在固体和液体培养基中对 2 种病原弧菌都有较强的拮抗作用。 徐长安 15等人
10、自海滩污泥中分离出一株海洋生境枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)LHB02，其发酵产物对海水养殖常见致病菌弧 菌有很强拮抗能力。采用硫酸铵沉淀、 Sephadex G-50 凝胶层析等方法，进一步对 LHB02 发酵产物分离纯化，获得了分子质量为 47ku 单一条带的糖蛋白。经抗菌活性分析及稳定性测试发现，纯化后的抗菌蛋白对哈维氏弧菌 (Vibrio harveyi)、溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus)和鳗弧菌 (Vibrio anguillarum)有很强的抑制作用，对热稳定及酸的耐受性也比较强 (pH 3.08.0)，但对部分蛋白酶敏感。 LHB02
11、所产抗菌蛋白的强抑菌作用和高稳定性，预示着该菌可作为一种生防细 菌开发，用于大黄鱼养殖中弧菌病的防治。 苏浩等 16人采用牛津杯抑菌圈检测法，探讨了 4 株芽孢杆菌 ( K、 S、 BA、 SN) 代谢产物对溶藻弧菌的抑制能力，用三角烧瓶稀释法模拟养殖水体，探讨了枯草芽毕业论文 - 孢杆菌 SN 对溶藻弧菌的抑制效果。结果显示， K、 S、 BA 没有抑菌活性， SN 有明显抑菌活性，在模拟养殖水体中， 104 l06cfu/ml 的 SN 溶液对溶藻弧菌有明显的抑制作用，其抑制作用随溶藻弧菌菌量的增大而减弱。进一步尝试用 SN 培养液来控制鲍养殖池中底栖硅藻上弧菌的数量， 104 cfu/m
12、l 的 SN 对弧 菌有较好的抑制作用。 杨莺莺等 17人以溶藻弧菌 T1 和 鲨鱼弧菌 T2 为检测菌，采用平板抑菌圈检测法，研究乳酸杆菌 L1 及其代谢产物的抑菌能力。结果表明： L1 发酵上清液对两种弧菌的抑制效果和发酵液对弧菌的抑菌作用相似，即对弧菌 T1 的抑制作用强于 T2； L1发酵液对弧菌 T1、 T2 的抑制能力强于上清液，表明乳酸杆菌及其代谢物质对弧菌具有协同抑制作用； L1 的发酵液经 3 倍稀释仍对弧菌 T1 有抑制作用；乳酸杆菌 L1生长不同时期的代谢产物对弧菌的抑菌活性不同，代谢产物的抑菌能力在衰退期 稳定期 生长期； L1 的发酵液经沸水浴处理 15min。其抑菌
13、活性不变，表明抑菌代谢物质具有较好的耐热性。 本研究的实验对象是酵母菌 PY-1，其是浙江海洋学院微生物实验室从舟山海域土壤样品中分离得到的，研究表明该菌对溶藻弧菌（ V.alginolyticus）具有较强的抑制作用，通过对菌株 PY-1 发酵条件的研究，为工业化生产提供参考。 毕业论文 - 2 材料与方法 2.1 菌种 酵母菌 PY-1 由实验室保存并提供；溶藻弧菌 （ Vibrio alginolyticus） 作为指示菌购于中国普通微生物菌种保藏中心（ CGMCC） 2.2 培养基 YPD 液体培养基：酵母浸出液 10g，蛋白胨 20g，葡萄糖 20g， 溶解于 1LddH2O 中，调
14、 PH 值为 6.5。 115 灭菌 20min。 营养琼脂培养基：牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g， NaCl5.0g， 琼脂 15.0g-20.0g，蒸馏水 1000mL， pH7.4-7.6， 121 高压蒸汽灭菌 20min。 YSD 培养基： Yeast Nitrogen Base 6.7 g/L，葡萄糖 20 g/L，亮氨酸 200 mg/L，腺嘌呤 100 mg/L，肌醇 200 mg/L， 112 灭菌 20 min。 YSD 固体培养基： 100 mL YSD 培养液加琼脂 粉 1.5 g。 2.3 主要试剂与设备 2.3.1 主要试剂 5%的 NaOH 溶液：称取 5g
15、 氢氧化钠溶于 100mL 水中。 2.3.2 设备 低速离心机 型号： LD5-2B，北京雷勃尔离心机有限公司 上皿电子天平 型号： FA2004，上海精科天平有限公司 超净工作台 型号： HT-CJ-1，安徽航天生物科技有限公司 恒温振荡器 型号： THZ-C，江苏太仓市实验设备厂 恒温培养摇床 型号： THZ-103B，上海一恒科学仪器有限公司 恒温培养振荡器 型号： NSKY-100B，上海苏坤实业有限公司 分体落地式空调器 型 号：分体落地式 KFR-12，广东顺德美的冷气机制造有限公司 智能人工气候箱 型号： RXZ，宁波江南仪器制造 电冰箱 型号：海尔： BCD-257，青岛海尔
16、股份有限公司 马头牌架盘药物天平 型号： BP-II，上海医用激光仪器厂 电子天平 型号： BS124S 型，塞多利斯科学仪器 (北京 )有限公司 立式压力蒸汽灭菌器 型号： LAZX-75KB 上海申安医疗器械厂 此外还需电炉，锥形瓶，玻璃棒，移液枪，培养皿，烧杯，打孔器等。 毕业论文 - 2.4 方法 2.4.1 菌种扩大培养 对筛选出的酵母菌 PY-1 进行扩大培养。将细胞悬浮液 涂于 YSD 板上， 30 培养 4-6 天。 2.4.2 蛋白的表达 挑取 YSD 板上直径为 0.5-1mm 菌斑于 3mLYSD 溶液中扩大培养 12h，然后以1： 25 的比例转入 50mLYSD 溶液
17、中， 30 ， 250 转 /min 培养 12 小时；最后以 1：25 的比例转入 1LYPD 溶液中， 30 ， 250 转 /min 扩大培养 3-4 天。开始发酵实验。 2.4.3 制备平板培养基 实验前制备好营养琼脂培养基并灭菌。实验时待锥形瓶表面温度不烫手时 ,每50mL 培养基中加入 100L溶藻弧菌，倒好平板，在水平台上静置一段时间。 2.4.4 发酵液的制 备 挑取目标菌株接种于对应的液体培养基中，按照 50mL/250mL 装瓶量在实验设定的条件进行发酵培养，发酵产物用低速离心机在 4000r/min 进行离心，取上清液测定抑菌活性 18,19,20,21。 2.4.5 抑
18、菌活性测定（琼脂扩散法） 选用特定的打孔器，将蘸有酒精的打孔器在酒精灯上点燃后立即移开 ， 待酒精燃烧完全后即达到灭菌效果。 利用琼脂扩散法 22,23,24,25在加有指示菌的培养基上利用移液枪 向每个孔洞中注入 50ul 的 液体 ，其中一个孔洞做空白对照， 35 培养 1d，观察结果并测定抑菌圈的大小。其中 以溶藻弧菌作为指示菌。 2.4.6 发酵单因素试验 2.4.6.1 最适温度的选择 26 以 2%接种量，接种于装有 50mLYPD 液体培养基的 250mL 锥形瓶中，分别以25 、 28 、 30 、 35 为培养温度， 250 转 /min， pH6.5，培养 3d，利用琼脂扩
19、散法分别测定抑菌圈直径。 2.4.6.2 最适培养时间选择 27 以 2%接种量，接种于装有 50mLYPD 液体培养基的 250mL 锥形瓶中， 30 ，250 转 /min， pH6.5，分别以 3d、 5d、 6d、 7d、 8d，利用琼脂扩散法分别测定抑菌圈直径。 2.4.6.3 最适接种量选择 28 分别以 1%、 2%、 5%、 8%为接种量，接种于装有 50mLYPD 液体培养基的 250mL锥形瓶中， 30 ， 250 转 /min， pH6.5，培养 3d，用琼脂扩散法分别测定抑菌圈直径。 毕业论文 - 2.4.6.4 最适 pH 值选择 29 以 2%接种量，接种于装有 5
20、0mLYPD 液体培养基的 250mL 锥形瓶中， 30 ，250 转 /min， pH 分别控制在 5.5、 6.5、 7.5、 8.0，培养 3d，利用琼脂扩散法分别测定抑菌圈直径。 2.4.7 正交试验 根据单因素试验结果，采用 4 因素 3 水平 L9（ 34） 正交表 30,31,32,33对发酵温度、酵母接种量、培养时间、 pH 等 4 个因素进行正交组合，在培养基上加入 溶藻弧菌作为指示菌，以抑菌圈的直径为指标进行发酵条件的优化。 毕业论文 - 3 结果与分析 3.1 发酵单因素试验 注：发酵单因素试验所用打孔器直径： 6.11mm，所测抑菌圈直径单位： mm。发酵培养时间（除培
21、养时间试验 外 ）都是 3d。 3.1.1 不同温度下的抑菌活性 不同温度对菌株 PY-1 抑菌效果的影响如表 1 所示，培养温度为 25 时抑菌效果最佳，随着温度的上升抑菌圈直径变小，抑菌效果减弱。 表 3.1 不同温度下的抑菌圈直径 Tab.3.1 under different temperature of antibacterial of circle diameter 实验组 对照组 温度 平板一 平板二 平板三 平均值 25 8.87 9.55 10.38 9.60 0 28 8.84 9.01 9.74 9.20 0 30 8.36 8.58 8.68 8.54 0 35 0 0 0 0 0 9.609.208.540.000.002.004.006.008.0010.0012.0025 28 30 35温度（)抑菌圈直径（mm）图 3.1 不同温度对抑菌效果的影响 Fig.3.1 different temperature on antibacterial effect
