1、毕业论文 - 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 曼氏无 针乌贼 雌体 纳 精囊的 结构 及 对 精子存储研 究 学 院： 学生姓名： 专 业： 生物科学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 - 目录 摘要 . I Abstract . II 引言 .III 1 实验 材料 与 方法 .1 1.1 实验 材料 .1 1.2 实验药 品 与试剂 .1 1.2.1 实验 室所用的基本 试剂 .1 1.2.2 自配 试剂 .1 1.3 实验仪 器和 设备 .1 1.4 实验 耗材 .2 1.5 实验 方法 .2 1.5.1 解剖 学观 察 .2 1.5.2 组织学研 究 .2 1.5.
2、3 电镜样 品制 备 及 观 察 .3 2 结 果 与 分析 .4 2.1 纳 精囊 结构 .4 2.2 精子在 纳 精囊中的存在 .4 3 实验讨论 .8 3.1 头 足 类 的精子 竞争 和精子 选择 .8 3.2 曼氏无 针乌贼纳 精囊的 结构 特征 与 其功能的适 应 性 .9 结论 . 11 参 考文 献 . 12 致 谢 . 13 毕业论文 - 曼氏无 针乌贼 雌体 纳 精囊的 结构 及 对 精子存 储研 究 摘要 【摘要】 本文采用活体解剖和 组织 切片及 电镜 技 术 主要 对 曼氏无 针乌贼纳 精囊的结构 及精子的 存 储进 行了初步的 研 究 ，曼氏无 针乌贼 的 纳 精囊
3、是位于 雌体口膜腹侧 ，繁殖季 节为 一 对 乳白色分枝 状 囊 状结构 ， 内 含大量的精子，有一 对 乳突 状 突起 开 口于 纳 精囊 内侧 ， 两 者相距 数 毫米， 轻压纳 精囊可 见 精子 从 乳突 开 口涌出，但精子 并 不 运动 。 纳 精囊 组织学观 察， 纳 精囊 周 围 分布大量的肌肉 组织 ，每 个 小囊体由 周 围 大量的立方 纤 毛上皮 细 胞和中 间 囊腔 组 成， 细 胞中皆有 椭圆 形的胞核。 这 些肌肉 组织 和 纤 毛可能在控制精子 纳 精囊 结构 方面起重要作用。 电镜观 察显 示， 纳 精囊 内 精子按一定 规 律排序， 纳 精囊中精子周 围 存在大量
4、囊泡； 纳 精囊壁立方 纤 毛上皮 细 胞中，也存在大量囊泡，囊泡中含有 颗 粒物 质 ，推 测 此 颗 粒物质 具有抑制精子代 谢 作用。本 研 究可 为 曼氏无 针乌贼 繁殖生物 学 的 进 一步了解提供基 础资 料。 【关键字】 曼氏无 针乌贼 ； 纳 精囊； 精子 储 存 毕业论文 - The Sepiella maindroni spawn, structure and sperm storage Abstract 【 abstract】 In this paper, vivisection and tissue sections and electron microscopic t
5、echniques carried out a preliminary study the following conclusions on the structure of the Man maindroni can spawn and sperm storage The seminal receptacle is located in the ventral portion of the buccal membrane surrounding the buccal mass, and opens inside the buccal membrane. It form branched sh
6、apes, consists of several sacs. The sacs connect each other and the wall of each sac consists of cuboidal ciliated epithelial cells (with oval nuclei) surrounded by a muscular tissue.Sperm always locates bottom of the sacs, arranging ragularly, with much particle material surrounded. And particle ma
7、terial possesses the ability of metabolic inhibition. 【 keywords】 Sepiella maindroni ; seminal receptacle; sperm storage 毕业论文 - 引言 曼氏无 针乌贼 Sepiellamaindroni隶 属乌贼 目、 乌贼 科、无 针乌贼属 ， 俗 称墨 鱼 ， 它 曾是我 国渔场 的 “ 四大海 产 ” 之一， 在我 国 沿海分布很广， 尤以浙江 东 海北部分布最多， 是一 种经济 价 值 很高 的 传统渔业种类 。 我 国 著名的 “ 墨鱼 干 ” 、 “ 螟蛹 誊 ” 、 “
8、乌鱼 穗 ” 、 “ 乌鱼 蛋 ” 等 产 品均主要是曼氏无 针乌贼 及其性腺的干制品。但 20 世 纪 80 年代中期以 来 ，由于人 为过 度捕 捞 和 产 卵 场 生 态环 境的破坏，曼氏无 针乌贼 自然 资 源 严 重衰退， 已近枯竭，形 势 十分 严 峻。 近年不 断 的 对头 足 类 的增 养 殖， 对头 足 类 的生活 习 性、生活的 环 境； 关 于曼氏无 针乌贼 形 态构 造、繁殖行 为 、卵巢 发 育、生理、 资 源增殖 与 繁殖保 护 等方面的 研 究已有相 关报 道。但是有 关 其生殖系 统 的 结构 和功能方面的 研 究 还 不深入。 纳 精囊，作 为 主要的精子 储
9、 存器官存在于 头 足 类 十足目雌性 类 群的口膜 。在交配 过 程中，伴 随 着精 荚 放射及精子囊吸附于雌性，雄性 将 精子巧妙地 输 送 给 雌性，同 时 雌性 将 精子巧妙的 储 存起 来 ， 备 用或者 选择 性使用。因此，精子的 储 存是 头 足 类 繁殖生物 学研 究中的重要 内 容之一。 国 外 学 者 对 精子的 储 存机制工作早已深 入 开 展，包括 纳 精囊 结构 及 数 量、雄性精子 竞争 机制、雌性精子 选择 机制等研 究 课题 ，目前 尚 无 国内学 者涉足 头 足 类纳 精囊及精子 储 存 研 究。本文 拟 采用解剖 显 微 观 察法、 组织 切片技 术 及 电
10、镜 技 术对 曼氏无 针乌贼纳 精囊的 结构 及精子的储 存 进 行初步 研 究，旨 为 深入了解曼氏无 针乌贼 的繁殖生物 学 ， 从 而 为 更好地 对曼氏无 针乌贼进 行繁育和 增 养 殖 开发 提供基 础 。 毕业论文 - 1 实验 材料 与 方法 1.1 实验 材料 实验 用曼氏无 针乌贼 （ Sepiella maindroni）于 2011 年 10 月取自浙江大海洋科技有限公司秀山苗 种 繁育基地， 选 取健康成熟的、口膜上有精 子囊吸附的雌性 个 体， 20 只左右，全 长 为 10.10-13.30cm，体重 为 44-86g。活体取回后在 实验 室 暂养备 用。 1.2
11、实验药品与试剂 1.2.1 实验 室所用的基本 试剂 去离子水： 实验 室自制 无水乙醇： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 苦味酸： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 苏 木精： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 地衣 红 ： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 中性 树胶 ： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 石蜡： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 二甲 苯 ： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 Bouins 液 ： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 纯 丙 酮 ： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 冰乙酸： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 酚 ： 国药 集 团 化
12、学试剂 有限公司 磷酸： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 浓盐 酸： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 醋酸 铅 ： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 醋酸 铀 ： 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 1.2.2 自配 试剂 柠檬 酸 铅 溶液 醋酸双氧铀 50%乙醇饱 和溶液 磷酸缓 冲液 1.3 实验仪 器和 设备 LEICA DM4000B 显 微 镜 ： 北京京 百卓 显 科技有限公司 JEM-1230 型透射 电镜 ： 日本 JEOL 公司 石蜡切片机： 徕 克 医疗 有限公司 海尔冰箱（ 4、 -20）：海尔 BCD-539WF 型， 对开门 ，中 国 海尔集 团 毕业论文
13、 - 三菱冰箱（ -70）：三菱 BCD-123 型，上海三菱 电 器制造有限公司 ： 锥 形 瓶 ：容量 250ml，中 国医药 （集 团 ）上海化 学试剂 公司 烧 杯：容量 100ml， 500ml， 1000ml， 国药 集 团 化 学试剂 有限公司 量筒：容量 50ml， 100ml， 250ml，中 国医药 （集 团 ）上海化 学试剂 公司 广口 瓶 ：容量 250ml， 500ml， 国药 集 团 化 学试剂 有 限公司 移液器：容量 2.5ul、 10ul、 20ul、 100ul、 200ul、 1000ul，法 国 Gilson 公司 实验 室 PH 计 ： FE20 型，
14、上海梅特勒 -托利多 仪 器有限公司 Nikon DXM1200F 生物体 视镜 ：日本 Nikon 公司 SEM 扫 描 电镜 ：北京美同 达 有限公司 TM-1000 型 扫 描 电镜 ： 日立 HITACHI 公司 TEM 透射 电镜 ：北京美同 达 有限公司 1.4 实验 耗材 玻璃棒： 购 自江 苏 省泰 兴 市振科 仪 器 厂 一次性 PE 薄膜手套： 购 自上海市 医 用 卫 生材料 厂 解剖 针 ： 购 自江 苏 省泰 兴 市振科 仪 器 厂 解剖刀： 购 自上海市 医 用 卫 生材料 厂 1.5 实验 方法 1.5.1 解剖 学观 察 取样 本（曼氏无 针乌贼 ）利用解剖 针
15、 和解剖刀 将 其解剖 观 察雌性 个 体口膜上纳 精囊情 况 ，包括 纳 精囊形 态 特征、 数 量、位置等， 并进 行 拍照认真记录 。 注意在实验过 程中操作要小心不要割坏了 纳 精囊的 结构 ，保持 结构 的完整性， 这样 才不 会对 下面的步 骤 造成影 响 。 同时 也便于我 们 的 观 察。 1.5.2 组织学研 究 1.取材 : 取活体曼氏无 针乌贼 雌性成熟 个 体的 纳 精囊，保持 纳 精囊的完整，取出后放入苦味酸中固定。 2.脱水和透蜡 : 将组织 取出放到 70%酒精中 脱 水 20 分 钟 ，然后放入 83%的酒精 脱 水 30 分钟 ，再放在 95%的酒精中 脱 水
16、 30 分 钟 ，接着放到 100%的酒精中 脱 水 45 分 钟 ，继续 放到 45%的酒精中 脱 水 45 分 钟 ，放到二甲 苯 酒精（ 1： 1）中 30 分 钟 ，最后放到二甲 苯 中 30 分 钟 。然后取出放到二甲 苯 石蜡中（ 2： 1）中，保持二甲 苯 石蜡 温 度 31 摄 氏度左右 40 分 钟 ，在放到二甲 苯 石蜡（ 1： 2）中，保持二甲 苯 石蜡温 度 43 摄 氏度左右。最后 将组织 放入 纯 石蜡溶液中。（石蜡的熔点在 68 摄 氏度毕业论文 - 左右）注：放入不同的烘箱 内 先升 温 使石蜡熔化再降下 来 到石蜡 开 始凝固，即凝固 临 界点，然后 将组织
17、取出投入石蜡溶液中。 3.包埋 : 先 将 石蜡融化在 等到即 将 凝 结还没 凝 结 的 时 候 将 透好蜡的 组织 放到石蜡中，然后 将 石蜡冷却。 4.切片 : 包埋好后 将 包埋好的石蜡切成方 块 ，要方 块尽 量小但是不影 响 到 组织 ，接着将这个 方 块 固定在切片机的那 个 小木 块 上 并 固定好在切片机上。切片用 7 微米的那 个 刻度，切的 时 候要 尽 量保持所切的切片 长 且不 断 。切好的切片先放在白 纸 上并 排好序，不要打 乱 次序，然后 将 切好的切片放在用合成蛋白抹 过 的 载 玻片打夯，滴上一滴蒸 馏 水， 尽 量的 将 切片放平，用 标签纸 作好 记号
18、。接着 将 放好的切片放在展片机上等切片完全的展平，在 这个过 程中要注意不要 让 切片上的水干掉，如果水快干了切 片 还没 完全展 开 的 话 要 记 得加蒸 馏 水到展片完全展 开为 止。 5 染色 按如下流程：切片 蜡片 放入二甲 苯 中 15 分 钟 1/2 二甲 苯 .1/2 酒精 15分 钟 100%酒精 5 分 钟 95%酒精 5 分 钟 83%酒精 5 分 钟 70%酒精 5 分 钟 50 酒精 3 分 钟 35%酒精 3 分 钟 自 来 水 1.5 分 钟 蒸 馏 水 1.5 分 钟 苏 木精 4分 钟 水洗 1%盐 酸酒精（ 70%） 3 到 5 秒 蒸 馏 水洗 3 分
19、钟 70%酒精 脱 水 5分 钟 83%酒精 脱 水 5 分 钟 90%酒精 脱 水 5 分 钟 1%伊 红 酒精（ 95%）溶液4 分 钟 95%酒精分色 3 分 钟 纯 酒精 脱 水 5 分 钟 纯 酒精 脱 水 5 分 钟 二甲苯 5 分 钟 二甲 苯 5 分 钟 封片（光 学树胶 ）。在 这个过 程要 较为严 格的控制时间 ，因 为 如故 哪个环节 出 错 有可能整 个过 程染色 过 程都很 难 看。 1.5.3 电镜样 品制 备 及 观 察 TEM（透射 电镜 ） 样 品制 备 ：曼氏无 针乌贼纳 精囊 样 品在 2.5%的戊二 醛 溶液中 4固定 过 夜，然后用 0.1M， pH7
20、.0 的磷酸 缓 冲液漂洗 样 品三次，每次 15min；然后再用 1%的 锇 酸溶液固定 样 品 1-2h，用 0.1M， pH7.0 的磷酸 缓 冲液漂洗 样 品三次，每次漂洗 15min； 进 行乙醇梯度 脱 水后用 纯 丙 酮处 理 20min。用包埋 剂 梯度渗透 样 品，分装包埋， 70加 热过 夜。在 Reichert 超薄切片机中切片， 获 得 70-90nm 的切片， 经柠檬 酸 铅 溶液和醋酸 双氧铀 50%乙醇 饱 和溶液各染色 15min，在日本 JEOL 公司的 JEM-1230 型透射 电镜 中 观 察。同 样 的 进行拍片和 数 据的 认真记录 。 毕业论文 -
21、2 结 果 与 分析 2.1 纳 精囊 结构 纳 精囊位于交配期雌性曼氏无 针乌贼 的腹部口膜周 围 ，共一 对 （ 图 5-1a）。未交配 过 的成熟雌性 乌贼 ，由于 没 有精 荚 吸附于上更易 观 察。 从 口膜正面看， 类似 两个 白色小乳突 状结构 （ 图 5-1b）； 从 口膜的反面看，更易 观 察， 结构清 晰（ 图 5-1a）。 活体解剖， 将纳 精囊取下，直接置于 显 微 镜观 察 观 察，（ 图 5-1c、 d），可 见纳 精囊呈分枝 状 ，其中分成 5 到 20 个 不等小囊体，小囊体的大小不均一，且各 个 小囊体相互 连 接 贯 通。 纳 精囊 组织学观 察， 纳 精囊
22、周 围 分布大量的肌肉 组织 （ muscular tissue），每隔小囊体由大量的立方 纤 毛上皮 细 胞（ cuboidal ciliated epithelial cells） 组 成，细 胞中皆有 椭圆 形的胞核（ 图 5-1e）。 2.2 精子在 纳 精囊中的存在 垂直于 纳 精囊 开 口方向， 从开 口至囊底 横 切， 显 示精子在 纳 精囊中的存在的几 个阶 段。第一 阶 段， 开 口位置的小囊体中 并 无精子存在，整 个 囊体充 满 立方 纤毛上皮 细 胞（ 图 5-2a），囊体 数 量少；第二 阶 段，小囊体中的立方 纤 毛上皮 细胞沿着囊体四周分布，此 时并 无精子出 现
23、 （ 图 5-2b）；第三 阶 段，可 见 囊体中出 现 了精子， 数 目不多（ 图 5-2c）；第四 阶 段，囊体中出 现 一定的 数 目的精子，精子排列 杂乱 无章（ 图 5-2d）；第五 阶 段，囊体中出 现较 多 数 量的精子，精子排列出 现 一定的秩序（ 图 5-2e）；第六 阶 段，囊体 数 量增多，精子布 满 了囊体，所有精子排序出 现 一定的 规 律（ 图 5-2f）。囊体 内 精子 按一定 规 律排序，囊体之 间 的精子排序 规 律 并 不一定相同（ 图 5-2g）。 从纳 精囊中 挤 出少 许 白色粘液，置于事先准 备 好的存在活 跃 精子的海水液滴中， 镜检显 示，精子活
24、 跃 度 随 之下降， 并进 入 静 止 状态 。 随 后，向液体加入海水，冲淡白色粘液的 浓 度，精子 随 后恢 复 活 跃状态 。此 过 程 说 明，精子在 纳 精囊中不活 跃 的。 结 合上述切 纳 精囊透射 电镜镜检显 示， 纳 精囊中精子周 围 存在大量囊泡（ vesica）（ 图 5-2h）； 纳 精囊壁立方 纤 毛上皮 细 胞中，也存在大量囊泡（ vesica），囊泡中含有 颗 粒物 质 （ 图 片中精子 数 量的 变 化，推 测为 精子活 动 性能的 减 弱。 毕业论文 - a. 纳 精囊口膜反面 观 ； b. 纳 精囊口膜正面 观 ； c. 解剖 镜 下 纳 精囊 结构 ； d.解剖 镜 下 纳精囊 结构轮 廓； e. 纳 精囊 横 切，示立方 纤 毛上皮 细 胞和精子。 CCEC. 立方 纤 毛上皮 细胞； MuT. 肌肉 组织 ； SeR. 纳 精囊； SPM. 精子 . 图 5-1 纳 精囊的 结构
