1、毕业论文 - 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 三疣梭子蟹甲壳素酶基因的克隆与分析 学 院： 学生姓名： 专 业： 生物科学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 - 目录 摘要 . I Abstract .II 引言 . 1 1材料与方法 . 2 1.1 试剂仪器 . 2 1.1.1 主要仪器设备 . 2 1.1.2 试剂及其配制 . 2 1.1.3 试剂配制 . 2 1.2方法 . 4 1.2.1 三疣梭子蟹 血细胞全长 cDNA文库克隆子的测序 . 5 1.2.2 三疣梭子蟹 chitinase 基因的 BLAST 检索 . 7 1.2.3 三疣梭子蟹 chitinase
2、基因的生物信息学分析 . 7 1.2.4 三疣梭子蟹甲壳素酶基因的组织表达分析 . 8 2 实验结果与分析 . 9 2.1甲壳素酶基因克隆子的鉴定 . 9 2.2三疣梭子蟹甲壳素酶基因的生物信息学分析 . 9 2.3三疣梭子蟹甲壳素酶组织表达分析 . 9 2.4本章小结 . 11 3 讨论 . 12 参考文献 . 13 致谢 . 14 毕业论文 - 摘要 摘要 甲壳素酶 (chitinase; EC 3 2 1 14)又称几丁质酶， 广泛 存在于节肢动物、软体动物、环节动物、原生动物、腔肠动物、海藻及真菌等中 。 在甲壳动物中，甲壳素酶除参与免疫反应外，还在甲壳动物的生长发育过程中起着至关重要
3、的作用 。本实验 通过筛选 三疣梭子蟹血淋巴细胞 全长 cDNA 文库 ， 克隆了一个 三疣梭子蟹 甲壳素酶基因 。 该 三疣梭子蟹 甲壳素酶 cDNA全长 910 bp，开放阅读框 编码 235 个氨基酸残基 ， N端 18 个氨基酸残基为信号肽 ， 成熟肽的分子量为 24384，理论等电点 pI=4.02； 与皮炎阿耶洛霉 (A. dermatitidis) 甲壳素酶序列比对显示 该 甲壳素酶 N 端大段缺失，但与之 C端高度同源 ；荧光定量 PCR 分析显示该 甲壳素酶 主要在 三疣梭子蟹 血液中表达，可能与血液的功能有关。 关键词 三疣梭子蟹；甲壳素酶；克隆；组织表达 毕业论文 - A
4、bstract Abstract Chitin enzyme (chitinase ; EC 3.2.1.14) say again chitinase, it widely in arthropods, software animals, animal, protozoa, link Q iangC hang animals, algae and fungi, etc exist. In crustaceans, chitin enzyme in addition to participate in immune response outside, still in the growth p
5、rocess of crustaceans plays a vital role. This experiment through the screening three warts swimming crab blood lymphocytes length of cDNA library, cloning a three warts swimming crab chitin enzyme gene. The three warts swimming crab chitin enzyme cDNA span 910 bp, open reading box code 235 amino ac
6、id residues, N end 18 amino acid residues for signal pept ide, mature peptide molecular weight for 24384, theory isoelectric point pI is 4.02; ermatitis and mildew, o los (A. dermatitidis) chitin enzyme sequence alignment shows that the enzyme N the lack of chitin long, but the C end highly conserve
7、d; Fluorescence analysis shows that the quantitative PCR chitin enzyme in three main warts swimming crab expression in the blood, and the function of blood may be relevant. Key words Portunus trituberculatus; chitinase; clone; tissue expression毕业论文 - 引言 甲壳素酶 (chitinase; EC 3 2 1 14)在细菌、真菌、植物和动物等生物类群
8、中广泛分布 1。在动物类群中，已报道了多种甲壳素酶及甲壳素酶类似蛋白 , 其中某些甲壳素酶在免疫反应中起着重要作用 2在节肢动物中，甲壳素酶是一个多基因的家族，如果蝇基因组中已报道了 18 个甲壳素酶及其类似蛋白基因 3在甲壳动物中，甲壳素酶除参与免疫反应外，还在甲壳动物的生长发育过程中起着至关重要的作用，甲壳素酶的正常表达是甲壳动物顺利蜕壳的关键 4，如果表达出现异常，则会出现蜕壳不遂等病症，影响其正常生长发育。 三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus)，属于甲壳纲，十足目是中国沿海的重要经济蟹类，分布于中国南北各海域。近年来三疣梭子蟹养殖业发展迅速，三疣梭子蟹养殖在
9、水产养殖业中占有极其重要的地位，但由于细菌，病毒等引起的病害也日趋严重，对三疣梭子蟹养殖业造成了很大的经济损失 5。其中蜕壳不遂症也是三疣梭子蟹养殖中的常见疾病，但在三疣梭子蟹中迄今未见甲壳素酶的报道，本研究拟通过文库测序筛选，克隆三疣梭子蟹甲壳素酶基因，为后续的功能和应用研究奠定基础。 毕业论文 - 1 材料与方法 1.1 试剂仪器 1.1.1 主要仪器设备 1、德国 Biometra T gradient PCR仪； 2、北京六一 DYY-6C型电泳设备； 3、美国 Bio-Rad公司凝胶成像系统； 4、 Eppendorf 5417R冷冻离心机 ； 1.1.2 试剂及其配制 1、 DNA
10、 Marker、 Taq酶为北京全式金公司产品； 2、 无水乙醇，异丙醇，异戊醇都是分析纯级； 3、琼脂糖凝胶购自上海捷瑞公司； 4、去离子水由美国 Millipore公司纯水系统制取； 1.1.3 试剂配制 1、氨苄青霉素溶液（ 100mg/ml）的配制： 1 将滤头灭菌。滤头灭菌前，安装滤膜时，不 要旋得太紧，待灭菌后使用前于超净台上用力旋紧，以防漏液。 2 称取 10g的氨苄青霉素粉末，倒入盛有 50ml去离子水的烧杯中，最好在烧杯上面盖个东西（封口膜或者干净的滤纸），以防止粉末飘出，轻摇烧杯，可见氨苄青霉素粉末迅速溶解； 3 待氨苄青霉素粉末溶解完，加去离子水至 100ml，稍等几分钟
11、让粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。 4 用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤头安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至离心管中。 5 分装成小份 -20贮存。需要时按浓度添加。 毕业论文 - 2、 LB培养基的配制 LB培养基组分：胰蛋白胨（ Tryptone） ： 10g/L；酵母提取物（ Yeast extract）：5g/L；氯化钠（ NaCl）： 10g/L LB培养基的制作过程： 1 称量：按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、胰蛋白胨、 NaCl放入烧杯中。注意蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗
12、净、擦干，再称取另一药品 ，瓶盖也不要盖错。 2 溶化：配制 1升的培养基则在上述烧杯中可先加 950ml的去离子水，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，定容至 1升。如果配制固体培养基，将称好的 15g琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。 3 调 pH：在未调 pH前，先用精密 pH试纸测量培养基的原始 pH值，如果 pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入 1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时 用 pH试纸测其 pH值，直至pH到达 7.6；反之，则用 1mol/L HCl进行调节。注意 p
13、H值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。 4 分装：分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 5 加塞：培养基分装完毕后，在三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 6 包扎：加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其 外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 7 灭菌：将上述培养基以 121.3， 20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放
14、入冰箱内暂存。 8 抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的 LB培养基置于 55的水浴中，待培养基毕业论文 - 的温度降到 55时（手可触摸）加入抗生素至所需浓度，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 9 培养基平板倒板：一般 10ml倒一个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外灯下照 10-15分钟。 10保存：放置于 4保存（平板用封口胶封边，并倒置），一个月内使用。 3、 TBE（ 0.5%）的配制： 1 称量药品 Tris 54g、硼酸 27.5g、 20 ml 0.5M 的 EDTA (pH8.0)，将上述称量好的药品装入 1L的烧杯中。 2 向烧杯中加入约 800 ml的去离子
15、水，充分搅拌溶解。 3 加去离子水将溶液最后定容至 1L，室温保存。 4 需要时再将 5 TBE稀释 10倍成 0.5 TBE便可使用。 4、 1%琼脂糖凝胶的配制： 1 称取 0.2g 的琼脂糖溶解于 20ml的 TBE（ 0.5%）中。 2 微波炉中约 2 分钟溶解胶（最好能煮沸 2 次以获得更好的胶的质量）。 3 冷却至 60加入溴乙锭 2 L倒入梳子等待凝固即可。 1.2 方法 1.2.1 三疣梭子蟹血细胞全长 cDNA文库克隆子的测序 三疣梭 子蟹血细胞均一化 cDNA文库为实验室采用 Clontech公司 SMART ( switching mechanism at 5 end o
16、f RNA transcript) TM cDNA 文库构建试剂盒构建的均一化cDNA文库，载体为 Clontech公司的 pGADT7-Rec Vector。克隆筛选为建库接头引物为SMART IV（ 5 - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT -3）和 CDS III（ 5 - ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG -3）。 1、取 1ul文库 菌液加到 100ul LB液体培养基，混匀，涂布在含 80 ug/ml氨苄青霉素的LB平板上， 37过夜培养，挑取克隆接种于 3ml含氨苄青霉素（ 50 ug/ml）的 LB液体培毕业论文 - 养基中 37， 250r
17、pm过夜培养。 2、菌落 PCR筛选 以克隆筛选引物 SMART IV和 CDS III对克隆进行 PCR扩增，筛选阳性克隆子。 PCR操作步骤如下： 1 在冰浴中，按 PCR反应体系 (表 4-1)将各成分加入 200 L的 PCR管中，其中，上述的菌液为模板，反应体积为 10 uL 表 4-1 PCR反应体 系 Table 4-1 PCR reaction system PCR 反应体系 10.0L体系 10x Buffer 1.0L dNTP 0.8L 10mM SMART IV 引物 0.4L 10mM CDS III 引物 0.4L DNA 模板 0.4L Taq DNA Polym
18、erase 0.1L ddH2O 6.9L 2 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置 PCR 仪上，执行扩增。扩增条件为： 95预变性 5min； 95 变性 30s， 55退火 30s， 72延伸 1min， 36 个循环； 72后延伸 10min。 3、 1%琼脂糖胶电泳检测 PCR产物 1 将 1%琼脂糖凝胶到入梳子，浇板，注意梳孔的体积能点下所有的样，并用枪头赶掉气泡，待凝固。 2 加入 2 L 上样缓冲液 （即 loading buffer）， 与 10LPCR产物混合均匀 。 3 用移液枪小心地将上样液垂直地加入加样孔，并记录点样顺序。每加完一个样品，换一个加样头，加样是应
19、防止碰坏样品孔周围的 凝胶面以及穿透凝胶底部。 4 接通电泳槽与电泳仪的电源，进行电泳。 5 在凝胶成像仪下观察并记录电泳结果。 毕业论文 - 4、质粒 DNA的提取 按小量质粒 DNA提取试剂盒说明操作： 1 挑取少量菌液划平板（ Amp 80 ug/ml）， 37 过夜培养，挑单克隆接种于含Amp（ 50 ug/ml）的 LB 液体培养基中， 37 ,180 rpm，培养过夜。（为了增加质粒拷贝数，可在培养基变混浊后加入 Cam，继续培养 1 2 h） 在超净工作台上，取 1-2 ml 过夜培养的菌液， 12000 rpm 离心 1 min，弃尽上清； 加入 200 ul Solution
20、 I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌； 加入 200 ul Solution II，立即温和并充分地上下翻转混合 4-6 次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的蛋清状溶液，此步骤不宜超过 5 min； 加入 350 ul Solution III，温和并充分地翻转混合 8-10 次，室温放 置 2-5 min，12000 rpm， 10 min。 将步骤 4 中的上清转移到套放于 2 ml 收集管内的 Gen Clean Column 中，室温12000 rpm， 1 min，取出 Gen Clean Column，倒掉收集管中废液。 将 Gen Clean Column 重新放回收集管中，加入 50
21、0 ul Solution IV， 12000 rpm，室温离心 1 min，倒掉收集管中废液。 将 Gen Clean Column 重新放回收集管中，加入 500 ul Wash Solution， 12000 rpm，室温离心 1 min，倒掉废液。 重复步骤 8 一次，倒掉收集管中废液， 12000 rpm，室温离心 1 min，彻底去除Wash Solution 将 Gen Clean Column 放入干净的 1.5 ml 离心管中，在 Gen Clean Column 膜中央加入 30-50 ul去离子水， 37 放置 2 min， 12000 rpm，室温离心 1 min。离心管中的液体即为包含载体质粒的溶液，取 2-5 ul 进行琼脂糖凝胶电泳检测， -20 保存。 5、测序 质粒 DNA送上海美季生物公司测序鉴定，测序引物为 T7 Sequencing Primer （ 5 - TAATACGACTCACTATAGGGC -3），测序结果用分析软件 Sequencher 4.2分析整理，切除载体序列、检索测序 contig， 并校正测序错误。 1.2.2 三疣梭子蟹 chitinase 基因的 BLAST 检索 测序处理得到的 contig一 致序列在 NCBI nr protein database中 BLAST检索同 源蛋白质6。
