1、毕业论文 - 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 小黄鱼微卫星标记的开发与筛选 学 院： 学生姓名： 专 业： 生物科学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 - 目录 摘要 . I Abstract . II 引言 . 1 材料与方法 . 3 1.1 材料 . 3 1.1.1 仪器与设备 . 3 1.1.2 仪药品与试剂 . 4 1.2实验方法 . 5 1.2.1 小黄鱼基因组 DNA的提取 . 5 1.2.2 酶切 . 5 1.2.3 接头的制备与连接 . 5 1.2.4小黄鱼基因组文库的建立 . 6 1.2.5探针杂交和磁珠富集 . 6 1.2.6富含微卫星序列的 PCR产物
2、及测序 . 6 1.2.7微卫星 PCR引物和电泳 . 7 1.2.8聚丙烯酰胺凝胶银染 . 8 结果与分析 . 9 2.1 DNA提取结果 . 9 2.2 酶切及适宜基因 组片段的获得 . 10 2.3 菌落 PCR检测重组率 . 11 2.4 测序结果及其序列分析 . 13 讨论 . 14 3.1 测序结果及序列分析 . 14 3.2 目标产物显色法的选取 . 错误 !未定义书签。 3.3 PCR 引物的优点 . 15 小结 . 17 参考文献 . 19 致谢 . 错误 !未定义书签。 毕业论文 - 小黄鱼微卫星标记的开发与筛选 摘要 小黄 鱼 （ Pseudosciaena polyac
3、tis）是我国重 要的海洋经济鱼类， 为研究 其 遗传结构 及种质资源现状，亟需要开发一批可用的微卫星分子标记 ，本实验采用 磁珠 富集文库法构建 了小黄 鱼的部分基因组文库，将 小黄 鱼基因组 的 DNA 用 限制性内切 酶 Mse 酶切，回收后进行纯化，提取到 300bp-1000bp 左右 大小 的 DNA 片段，用生物素标记的简单重复序列作探针与其进行杂交，将杂交 的 复合产物结合到有链霉亲和素包被的磁珠上，经过一系列的洗涤程序，去除磁珠表面未含有微卫星的片段。然后，将吸附在磁珠上的片段洗脱，利用 PCR 仪扩增放大所得的有效片段，再进行克隆和测序，根据各个微卫星两端的 保守序列设计引
4、物， 共 设计了 36 对引物，对舟山地区的 小黄 鱼进行群体遗传多样性分析，其中 11 对引物扩增出了清晰 并且能够进行多态性分析的 条带，即多态性高的目的片段。 小黄 鱼微卫星标记的开发和筛选等的研究工作可以为 小黄 鱼遗传种质资源分析 、资源保护 及遗传进化的研究提供更加详细和深入的信息。 关键词 微卫星 ； 小黄 鱼；种群多样性；多态性；分子标记 。 毕业论文 - Development and screening of microsatellites in Pseudosciaena polyactis Abstract Partial genomic library was con
5、structed in order to study the genetic structure of Pseudosciaena polyactis. In this experiment, we isolated microsatellite DNA from Pseudosciaena polyactis genome with this method. Pseudosciaena polyactis genomic DNA was extracted and digested with restriction enzyme MseI. Fragments over 300bp were
6、 isolated and purified and then ligated with short linkers. This genomic DNA was hybridized with a biotin-labeled microsatellite probe (CA) 13. The hybrid mixture was incubated with magnetic beads coated with streptavidin. After washing to remove the non-STR fragments, the eluted single-stranded DNA
7、 contains the selected microsatellite DNA. From the primers designed for the 36 microsatellite loci, 11 could amplify expected PCR products. The developing and screening of microsatellites in Pseudosciaena polyactis will provide more information for the research of heredity source analysis and hered
8、ity evolution, also benefits the future development of Pseudosciaena polyactis protection and Pseudosciaena polyactis artificial breeding to some extent. Key words Microsatellite; Pseudosciaena polyactis; Population diversity; Polymorphism; Molecular markers. 毕业论文 - 引言 小黄鱼 (Pseudosciaena polyactis)属
9、于脊索动物门 (Chordata)、硬骨鱼纲(Osteichthyes) ，鲈形目 (Perciformes) 、石 首鱼科 (Sciaenidae) 、 黄 鱼 属（ Pseudosciaena）。为近海底层结群性洄游鱼类，栖息于泥质或泥沙底质的海区。产卵场在沿岸海区水深 10 25 米，越冬场一般为 40 80 米，鱼群有明显的垂直移动现象，黄昏时上升，黎明下降，白昼栖息于底层或近底层。 由于其肉味鲜美，营养丰富，深受国内外消费者的喜爱。作为我国的知名的海洋经济鱼种，一度得到渔民的追捧，因此人为捕捞过度，小黄鱼的自然资源遭到过严重破坏 1,2。好在渔区社会保护渔业资源的意识和渔民休渔的自觉
10、性普遍较高，虽然小黄鱼的自然群体资源有了一定程度上 的恢复，但是可以发现我们在小黄鱼种质资源的保存和遗传研究上仍有很大空白，可见，对小黄鱼的研究已经不容我们懈怠了。目前已有学者对小黄鱼进行的研究分析，主要体现在小黄鱼的培育、小黄鱼加工和利用、小黄鱼生长和习性等方面的研究 3-5。 微卫星 DNA 又被称为简单重复序列（ simple sequence repeats， SSR）或短串联重复序列（ short tandem repeats， STR），是一类以少量个数核苷酸（约 1-6个）重复单位组成的简单多次串联重复序列，一般具有不超过 100bp 的长度。生物学家早在 20 世纪70 年代，
11、就得知真核生物基因组中存在短串联重复位点，但是过了将近 10 年，直至1982 年 Hamada6等发现从酵母到脊椎动物中的多重复多聚序列（ dT-dG），这些序列的数目和存在范围的广大才显现出来。这一发现后来被 Tautz 和 Renz 所证实 7。 1985年， Jeffreys 等科学家 8发现人基因组中含有更长重复单元基因的超变串联重复序列，即小卫星 DNA（ Mini-satellite）。与微卫星相同，小卫星的串联重复单位的数目也具有可变性，所以被统称为可变数目串联重复位点（ Variable Number of Tandem Rapeats VNTRs）。但在用于探针方面，小卫星
12、稍逊于微卫星。重复序列的重复次数和重复程度在不同的生物体内高度变化，并且随机分布于真核生物基因组中 9。微卫星的多态性可用 PCR 技术结合电泳来检测观察，就是将微卫星 DNA 特定地定位于染色体的某部位，接着用设计好的引物对基因组 DNA 进行 PCR 扩增，然后将产物在高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳来分离，检测多态性 10。微卫星标记可分为核心序列和两侧保守的侧翼序列两个组成部分。其中，保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则是形成微卫星的高度多态性的重要特点 11-12。毕业论文 - 微卫星上不同长度的等位基因按简单的孟德尔方式遗传，由于微卫星具
13、有高度的多态性，在基因组中含量丰富且分布均匀等优点。但是当前利用微卫星标记法的主要问题是，对一个新的研究物种在进行 SSR 标记的时候需要通过克隆建立它的基因文库。虽然利用近缘种部分微卫星作为微卫星引物序列的方法或许可行，但是绝大多数情况下可能没有作用，因为我们不能保证所有鱼类的微卫星侧翼序列都具有足够的保守性 10。 本文研究的目的是利用富集法建立微卫星富集文库 ，进行测序分析、基因型后筛选到一批具有高度多态性微卫星分子标记，可以用于后续的小黄鱼个体基因型的检测工作，群体中的微卫星位点等位基因的数目和频率的统计，结合分子遗传学和数量分类学原理，计算遗传变异程度、生存稳定性，初步评估小黄鱼的遗
14、传多样性，从而结合小黄鱼的遗传结构、生活背景和现状等等进行研究，有利于对小黄鱼做一个更完整深入的遗传分析。毕业论文 - 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器与设备 表 1.1 仪器一览表 仪器名称 型号，生产厂家 YXQ-LS-50A型压力蒸汽灭菌锅 由上海云泰仪器仪表有限公司生产 HHS 型电热恒温水浴锅 由上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产 DYY-10C型电泳仪 由北京六一仪器厂生产 凝胶成像系统 由 BIO-RAD公司生产 微型离心机 由 Qspin BAYGENE生产 超净工作台 由 SB-JC-IA型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产 磁珠固定架 由中国医药（集团）上海化学
15、试剂公司生产 电子天平 由 BS124S 型，塞多利斯科学仪器（北京）有限公司生产 移液枪 Eppendorf Research 可调量程移液 锥形瓶 容量 200mL， 250mL， 500mL由中国医药（集团）上海化学试剂公司生产 干燥箱 PH070A型，由上海 -恒科学仪器有限公司生产 96 孔板 由中国医药（集团）上海化学试剂公司生产 PCR仪 MyCycler 和 S1000，由 BIO-RAD公司生产 EP 管 由中国医药（集团）上海化学试剂公司生产 烧杯 容量 50mL， 100mL， 500mL， 1000mL，由国药集团化学试剂有限公司生产 量筒 容量 50mL， 100mL
16、， 500mL由中国医药（集团）上海化学试剂公司生产 枪头 10L 200L 1000L，由中国医药（集团）上海化学试剂公司 生产 毕业论文 - 1.1.2 药品与试剂 表 1.2 药品与试剂一览表 药品试剂名称 生产厂家 Bis-acrylamide（ 甲叉双丙烯酰胺 ） 由天根生化科技（北京）有限公司生产 苯酚：氯仿：异戊醇（ 25： 24： l） 国药 琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒 DP209-02 由天根生化科技（北京）有限公司生产 TEMED（四甲基二乙胺） 国药 acrylamide（ 丙烯酰胺 ） 国药 10%APS（ 烷基磺 酸 ） 国药 限制性内切酶 Mse 由天根生化科技（
17、北京）有限公司生产 PCR扩增引物 由上海英潍捷基贸易 有限公司生产生产 Solutron- 国药 蛋白酶 K 由天根生化科技（北京）有限公司生产 Mse- -N 由天根生化科技（北京）有限公司生产 PMD18-T 国药 无水乙醇 国药 75%乙醇 国药 氢氧化钠 由天根生化科技（北京）有限公司生产 甲醛溶液 由天根生化科技（北京）有限公司生产 亲和硅烷 国药 剥离硅烷 国药 酵母浸膏 由天根生化科技（北京）有限公司生产 TriS-Hcl 国药 TEN1000 国药 TEN100 国药 EDTA 国药 硝酸银 国药 琼脂粉 由天 根生化科技（北京）有限公司生产 Taq 酶 由天根生化科技（北京
18、）有限公司生产 X-Gal 国药 IPTG 国药 dNTP 由天根生化科技（北京）有限公司生产 尿素 由天根生化科技（北京）有限公司生产 磁珠 由天根生化科技（北京）有限公司生产 SDS 国药 TE 国药 毕业论文 - 1.2实验方法 1.2.1小黄鱼基因组 DNA的提取 本实验小黄鱼样本取自浙江舟山海域，按照酚 /氯仿抽提法从鱼肌肉中提取基因组DNA，其详细的方法和步骤如下： （ l） 将样品组织放入离心管内剪碎。加入 300 L 裂解液（ 0.02M TriS-Hcl， 0.05M EDTA， l%SDS），置于振荡器上震荡均匀。 （ 2） 加入蛋白酶 K6-7L 后，放入恒温水槽 37
19、水浴 3-4h 至溶液澄清，期间约水浴30min，颠倒混匀一次。 （ 3） 从水槽中取出后，晾至室温，加 300L 等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（ 25：24： l），进行温和颠倒混匀 10min直至乳浊状。 （ 4） 离心（ 10000r/min） 10min，小心吸取上清液，移至另一新的洁净离心管。 （ 5） 重复步骤（ 3）、（ 4），三至四次。尽量保持上清液的澄清。 （ 6） 在得到的上清液中加入 600L 的冰乙醇（无水，体积为苯酚：氯仿：异戊醇的两倍） 10000r/min离心 10min。 （ 7） 此时离心管底部能看到絮状的沉淀，小心地弃去上清液，加入 70%乙醇约100L，温和
20、缓慢吹洗 DNA 絮状沉淀， 10000r/min离心 10min后弃上清。 （ 8） 重复步骤（ 7） 一至二次（注：不要将 DNA 絮状沉淀丢弃）。 （ 9） 将 DNA 样品置于金属加热器中干燥，干燥所需时间根据管中乙醇残留量的多少进行适当的调整，加入适量 TE（ 10mM Tris-HCL， lmM EDTA， pH8.0）溶解，放置于 4 冰箱 待用，若要长期保存，需置于 -20 冰箱。 1.2.2 酶切 基因组 DNA 利用限制性内切酶酶切，具体按限制性内切酶说明书所示步骤进行。 1.2.3接头的制备与连接 用单链的寡核苷酸 来 制备接头，每一种单链寡核苷酸的浓度均为 10mol/
21、L。本实验采用 的是 Brown 接头：按 照 等比例 将 两组寡聚核苷酸链混合，这两条链的序列分别是 OligoA 和 OligoB，首先进行 95 变性 处理，经过 10min， 然后缓慢冷却 降 至室温，最终形成双链接头。建立 一个 20L 的 PCR 反应体系（接头 10mol/L， 1.5L； T4 毕业论文 - DNA 连 接酶 1L， 10Buffer2L， 经 纯化 处理 的酶切片段 10 L， 剩下由 无菌水补足体积 直 至 20L）。 16 连接过夜。 1.2.4 小黄鱼基因组文库的建立 （ l） PCR扩增 PCR程序： 94 下 变性 5min， 94 30s； 55
22、1 min； 72 1 min， 30 个循环，循环结束后再 在 72 条件下 延伸 10 min。 连接产物 PCR反应 表 1.3 PCR反应成分 体系成分 使用剂量 10Buffer 5L dNTP 3L Mse- -N 10L Taq 0.8L 10稀释链接 液 20L ddH2O 将体系 补至 50L （ 2） 特定大小的 DNA 片段的回收 将 PCR 产物进行琼脂糖电泳 10-15min，紫外灯 照射 下切割 琼脂糖 凝胶回收， 选择250-300bp 大小 以上的胶装入 新的 洁净 EP 管，然后利用 琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回收目 的 片段。 1.2.5探针杂交和磁珠富集 详细步骤参考文献 13。 1.2.6富含微卫星序列的 PCR产物及测序 （ 1） 连接载体 将纯化的 PCR产物与 T载体连接，按照以下体系于 16 连接过夜 表 1.4 载体连接体系 体系成分 使用剂量 PMD18-T 1L DNA 4L Solution- 5L （ 2） 克隆、转化和阳性克隆的挑选 将连接 所得 产物转入大肠杆菌感受态 细胞 中（ 100L）， 然后 冰浴 30min， 42 热
