1、毕业论文 文客久久网 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 重金属污染物对海洋生物的影响初探 学 院： 学生姓名： 专 业： 环境科学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 文客久久网 目录 中文摘要 .I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与设备 . 2 1.1 样品材料 . 2 1.2 实验试剂及药品 . 2 1.3 主要仪器与设备 . 2 2 实验方法及数据处理 . 3 2.1 半致死浓度（ LC50）简介 . 3 2.2 环境因素对重金属毒性的影响 . 3 2.3 对贝类生物死亡的判定 . 3 2.4 生物样品处理及 IR（红外光谱）测定 . 3 2.5 数据
2、分析方法 . 4 3 实验结果及分析 . 5 3.1 蛤蜊和文蛤的中毒反应 . 5 3.2 中毒症状分析 . 6 3.3 文蛤对重金属砷的 LC50 的值 . 6 3.4 同一时间不同浓度下文蛤的红外光谱图及特征官能团分析 . 7 3.5 同一浓度下不同时间文蛤的红外光谱图及官能团分析 . 8 3.6 同一时间不同浓度文蛤红外光谱指纹区数据聚类分析 . 10 3.7 同一浓度不同时间文蛤红外光谱指纹区数据聚类分析 . 11 结论与建议 . 12 参考文献 . 14 致谢 . 16 毕业论文 文客久久网 重金属污染物对海洋生物的影响初探 摘要 本次研究 用静态急性毒性试验的方法，研究 96h 内
3、重金属砷离子（ As5+） 对文蛤和蛤 蜊的毒性影响，并在此基础上进行受试生物的毒性来源追踪研究。实验方法为：对比不同重金属浓度下文蛤和蛤蜊的毒性影响，并用傅立叶红外光谱仪对生物体内的蛋白质特征官能团进行指纹区检测，最后用 SPSS 软件对指纹区数据进行聚类分析。结果表明 :代表五价砷离子对文蛤的急性毒性效应的72-hLC50 值为 0.108866mg/L，依据有毒物质对水生生物毒性标准的等级划分，该毒性影响属于剧毒等级。同时发现砷离子对生物的致死毒性影响并没有改变生物体内的蛋白质的结构。在重金属毒性效应方面发现：在同一时间下，重金属砷对文蛤的急性毒 性效应与重金属浓度成正比；在同一浓度下，
4、重金属砷对文蛤的急性毒性效应与实验时间成正比。 关键词 重金属； 贝类生物； 急性毒性； 指纹区分析； 聚类分析 毕业论文 文客久久网 Preliminary study of heavy metal pollutants on marine organisms Abstract Use the static acute toxicty test method, to research the toxic effects of the heavy metals arsemic ion(As5+) to clams and clam in 96h.And for the fingerprint
5、regionof the protein characteristics of light group on the invivo detection,to track the toxicity sources.The experimental methods is :compare the toxic effects of different coucentrations of heavy metals to clams and clam.And using fingerprint region detection with functional groups of the protein
6、characteristics of infrared spectroscopy invivo.The results shows that the acute toxicity values of the pentavalent arsenic ions on clams the 72hLC50 is 0.108866 mg/L.According to the toxic substances on aquatic life toxicity criteria.The toxicity belongs to a highly toxic rating.And the lethal toxi
7、city of arsenic ions on biological didnt change the protein structure of the invivo.In the heavy metal toxic effects,acute toxicity of heavy metals arsenic clams is proportional to the concentration of heavy metals at the same time.And the acute toxicity of heavy metals arsenic is proportional to th
8、e experimental time at same concentration. Key words Heavy metals; Shellfish; Acute toxicity; Analysis of fingerprint;region; Cluster analysis 毕业论文 文客久久网 引言 随着近三十年来工业的迅猛发展以及海洋资源的开发与利用，海洋污染程度逐渐加剧，相对于有机污染物而言，重金属污染物尤为显著。重金属污染物具有高毒性、高稳定性、能通过食物链富集以及直接影响被污染生物生殖发育的特点。大量的重金属污染物被排放到了海洋与河口交汇处对海洋水产养殖带来了严重的影响。一
9、方面由于重金属在生物体 内的积累与富集，造成食品安全隐患，另一方面直接导致相关海域生物的大面积死亡，直接影响沿海海域的生物群落构成。 有毒重金属元素在环境毒性研究中的很重要性很少有人怀疑，然而研究者普遍关注的只是汞、铅、铬。对于过渡金属：锰、镍、钴、铬和铜等，由于它们在代谢和酶催化过程中的作用，它们的生物毒性行为也一直在研究。但是从环境和毒理学的观点看，砷、硒、铍和矾将会变得日趋重要。而本次实验所研究的就是重金属砷的生物毒性。 长期接触无机砷会对人和动物体内的许多器官产生影响，如造成肝功能异常等。体内与体外两方面的研究都表明，无机 砷影响人的染色体。在服药接触砷（主要是三价砷）的人群中发现染色
10、体畸变率增加。可靠的流行病学证据表明，在含砷杀虫剂的生产工业中，呼吸系统的癌症主要与接触无机砷有关。还有一些研究指出，无机砷影响 DNA 的修复机制。据报道，摄入 As2O3 剂量为7080mg 时，可使人致死。 在对海洋环境重金属污染程度检测研究中，海洋贝类是全世界范围内应用广泛的标志指示生物。因为贝类生物对重金属毒性反应灵敏，能够反应出相关海域的污染程度，同时又具有移动性差、便于采集等特点，是很好的实验指示生物。而在贝类生物中，文蛤和蛤蜊这两种生物由 于其产地广泛，在中国沿海一带均有产出、易于采集所以本次实验中采用文蛤和蛤蜊两种贝类生物作为指示生物来做重金属砷（ AS）的毒性受性的研究。
11、文蛤（ Meretrix meretrix Linnaeus）南方俗称花蛤，又名菲律宾蛤仔，属软体动物门、双壳纲、真瓣腮目、帘蛤科、文蛤属。蛤蜊 (Mactra veneriformis)隶属软体动物门、双壳纲、异齿亚纲、帘蛤目、蛤蜊科。这两种贝类在中国长江口及沿海海域均有较大分布，其肉质鲜美、营养价值高。因其是重要的水产养殖经济贝类，研究其重金属毒性对它们的影响至关重要。毕业论文 文客久久网 1 材料与设备 1.1 样品材料 实验对象是新鲜的成体文蛤和蛤蜊，产地为中国舟山海域，从舟山当地海鲜菜场内购得。文蛤和蛤蜊进入实验室后放入充满海水的塑料饲养盆中，并用充气泵持续不断的充气。放置 3h，期
12、间禁止投入饵料。 3h 后选取伸展良好、反应灵敏、个体均匀的实验个体作为实验材料，实验样品花蛤长（ 45 10） mm，壳高（ 12 2） mm，湿体质量（ 40 8） g。蛤蜊长（ 28 6） mm，壳高（ 15 3）mm，湿体质量（ 56 10） g。 1.2 实验试剂及药品 （ 1） 实 验用海水取自舟山沿海海域海水，运送到实验室后经过沉淀，采取上层的 海水作为实验用水。水质分析结果： pH 7.968.20；盐度 31.18mg/L；温度 19.22。 （ 2） 重金属砷样品为 Na3AsO4 溶液，取自实验室，浓度为 100mg/L，分析纯，然后再用去离子水稀释成实验所需要的浓度。
13、1.3 主要仪器与设备 表 1 主要仪器厂家与规格列表 Table1 May equipment manufactures specifications 名称 生产厂家 规格 充气泵 上虞腾达电器有限公司 1.5kw/h 移液枪 eppendorf 1ml 冷冻浓缩管 LABCONCO 长： 3ft 直径： 0.75ft 冷冻浓缩机 LABCONCO 4.5L 傅立叶红外光谱仪 赛默飞公司 波长范围 7000400cm-1 压片机 华宇制药机械有限公司 最大片厚 40mm 毕业论文 文客久久网 2 实验方法及数据处理 2.1 半致死浓度（ LC50）简介 生物体对毒性物质的耐受性一般用半致死浓
14、度（ LC50）表示，它是从浓度（或对数形式）与死亡率的关系分析入手，计算出一个统一的致死 50%个体的理论浓度值，用来表示生物对某种药物或毒性物质的抵抗性。这个指标较准确也比较稳定的反应了 机体对毒物的反应，并可以对毒性物质的毒性进行比较。 LC50 还为进一步进行慢性毒理实验提供剂量选择的依据。 毒物的致死效应与受试动物暴露时间有密切关系。如果用 LC50 表示水中毒物对水生生物的急性毒性，必须在 LC50前标明暴露时间，如 24 小时 LC50、 48 小时 LC50和 96 小时 LC50等。 2.2 环境因素对重金属毒性的影响 影响重金属急性毒性的环境因素很多，如温度、水的硬度、溶解
15、氧、 pH值、盐度等。水温升高，贝类生物的呼吸活动加快，间接增强了重金属的毒性。水的硬度增强在一定程度上降低了重金属的毒性。 pH 值对重金属毒 性的影响尤为显著，当酸性环境时金属以离子态的形式存在毒性明显增强，碱性时，金属易形成不溶性碳酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氧化物或氢氧化物沉淀，降低了其毒性影响。盐度主要是改变了水环境 pH 值和重金属溶解度间接影响重金属毒性。 2.3 对贝类生物死亡的判定 个体的存活与死亡在理论上界限是十分清楚的，但是在实际操作中有时界限并不十分清楚，有一些个体中毒后蛰伏不动，应该归类为死亡一类，但如果给予一定的机械刺激（如轻轻触动一下），它又能做出一定的应激反应，似乎又
16、属于存活这一类。所以判定个体死亡的标准为贝类生物双壳张开、外套膜脱 落、贝肉变形并多次刺激无反应。 2.4 生物样品处理及 IR（红外光谱）测定 （ 1） 将文蛤和蛤蜊盛入海水中存放 24h，并用充气泵持续充气。使其适应实验室生存环境。 （ 2） 从中挑选出适量的反应良好，伸展活跃的文蛤和蛤蜊做为实验用的样品材料。 （ 3） 对文蛤和蛤蜊两种生物分别设立 5 个浓度组，其中一个为空白对照组，其余四个浓度分别为 0.025mg/L、 0.05mg/L、 0.075mg/L、 0.1mg/L。 毕业论文 文客久久网 （ 4） 每个浓度组中放入 10 个大小均匀，生长状况均良好的实验生物，并用充气泵
17、进行全天24h 的充气。 （ 5） 在实 验开始的前 6h 内，连续观察文蛤和蛤蜊的生长情况，并记录实验生物的各种异常行为，如对物理刺激反应变慢、双壳的张合异常、外套膜的脱落等，并及时清除死亡生物个体。 （ 6） 分别在 24h、 48h、 72h、 96h 各个时间点检查受试生物的状况，及时清除并保存好死亡个体（用保鲜膜包装好于 -10条件下保存）对死亡个体进行编号，记录各组 24h、 48h、 72h、 96h 的死亡数量。 （ 7） 在 96h 后，收集所有死亡个体，取出其贝肉进行压碎。并将同一浓度组内收集的死亡个体整合，盛入冷冻干燥管中并编号与 -20条件下冷冻 2h。 （ 8） 取出
18、冷冻干燥管，安装在冷冻干燥离心浓缩仪插孔上。在真空度 1000Pa，温度 -30条件下进行真空浓缩干燥 2h。 （ 9） 对浓缩后的生物样品取 2x2cm 的小片，盛入研体中加入适量的溴化钾固体进行充分的研磨，用压片机压缩成片。 （ 10）用傅立叶红外光谱仪对空白溴化钾压片先进行背景值的测定，并以此为背景分别测定样品压片的红外光谱值，相关数据在 OMNIC8.0 软件中处理成指纹区数据并保存。 2.5 数据分析方法 （ 1） 打开相关指纹区数据，截取 4002000cm-1 区间的红外光谱数据。 （ 2） 并以间隔 9 行数据 的宽度采集数据，共采集 50 组数据，并横向排列。 （ 3） 将排
19、列后的数据输入 SPSS18.0 数据分析表格中，并以数据系统聚类分析方式、相似性矩阵数据处理方式处理数据，得到相关的近似矩阵表、平均联结聚类表、平均联结树状图等相关处理后的数据。 （ 4） 收集各个浓度组分别在 24h、 48h、 72h、 96h 四个时间点的死亡个体数目，并以 10 为底做对数处理，分别在同一时间下以浓度为横坐标，死亡个数对数为纵坐标作曲线趋势图。 毕业论文 文客久久网 3 实验结果及分析 3.1 蛤蜊和文蛤的中毒反应 在实验生物放入饲养盆前，其生物性能良好，生物在海水中伸展正 常，会有水管伸出喷水的现象，用手触碰后反应灵敏。重金属溶液在不同的实验条件下试验生物会有不同的
20、中毒反应。实验开始 1h 内各组反应基本相同，双壳紧闭。随着实验时间的延长，中毒症状开始出现差异。 （ 1） 文蛤的中毒反应： 28h 内实验条件中的各组文蛤大部分都出现了都伸出了斧足和水管，在高浓度组中还出现了文蛤略微的抖动现象，大部分的文蛤开始分泌粘液，各个实验组中普遍有贝肉头触角发黑的现象产生。 24h 内部分实验组开始出现死亡现象，部分文蛤出现反应减慢的现象，高浓度组中已有部分文蛤尸体开始腐烂，分解。 48h 内中毒现象加 深，触角发黑现象更为普遍，文蛤抖动的现象消失，大部分生物紧闭双壳，外套膜脱落，各个浓度组生物普遍开始死亡。 72h 内死亡速度减慢，部分文蛤尸体贝肉已经分散，双壳依
21、然紧闭，饲养盆中开始散发腥臭味。 96h 内文蛤死亡数目增多，其文蛤死亡形态大多为双壳张开，贝肉紧缩。 （ 2） 蛤蜊的中毒现象：蛤蜊的中毒现象与文蛤大不相同。在整个实验过程中蛤蜊未发生过死亡，其中毒现象普遍为肉色由红变黑，但在 96h 内一直保持应激反应（应激反应速度变慢，在 96h 内大部分蛤蜊始终保持贝壳紧闭其空白对照组中贝壳微张。具体的各个浓度组在实验过程 中的死亡数量见下表： 表 2 文蛤生物在不同浓度、不同时间下的死亡数 Table2 the numbe of deaths for the clams in different concentrations and times 实验
22、浓度 (mg/L) 24h 48h 72h 96h 0 0 1 1 0 0.025 1 2 1 2 0.050 1 0 1 5 0.075 1 2 3 3 0.100 2 1 3 3 毕业论文 文客久久网 012345624 48 72 96实验时间(h)死亡样品数量(个)00.511.522.50 0.0025 0.0075 0.01重金属浓度(mg/L)死亡样品数目(个)图 2 0.05mg/L(As5+)浓 度组死亡曲线图 图 3 24h 生物样品死亡曲线 Figure2 0.05mg/L(As5+) concentration group death curve Figure3 24h
23、 death curve of biological samples 3.2 中毒症状分析 由表 2、图 2、图 3 可以看出，随着实验时间的延长和浓度的提高，重金属的急性毒性效应均有所提高，死亡率开始上升，其中 0.05mg/L 浓度组在 48h96h 时间段死亡率大幅升高。在同一浓度下，随着中毒时间的延 长，实验生物死亡数目整体的趋势是增多的。在同一时间下，随着浓度的增高，受试生物的死亡数目增加。整体上看从文蛤和蛤蜊的急性中毒症状，可以看出随着实验时间的延长，重金属浓度的增加中毒现象加深。但文蛤和蛤蜊对重金属砷的急性毒性反应大不相同。从中可以看出文蛤的急性毒性效应明显，但蛤蜊的中毒效应不明
24、显，甚至没有死亡。此次所设的 0.025、 0.05、 0.075、 0.1mg/L 的四个浓度组对蛤蜊的急性毒性偏小，蛤蜊对重金属砷的毒性耐受性比文蛤更强。至少 0.01mg/L 的浓度没有达到蛤蜊的致死浓度。 3.3 文蛤对重金属砷的 LC50的值 重金属浓度死亡数对数y = 0.4872Ln(x) + 1.7794-0.200.20.40.60.811.20 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25重金属浓度(mg/L)生物死亡数对数图 4 重金属浓度 死亡生物对数曲线图 Figure4 concentration of heavy metals death curve 由图 4 的对数曲线图得到 72h 的重金属砷对文蛤的 LC50 值为 0.108866mg/L，在国内其他重金属毒性对贝类生物研究中都提出了采用 72h 或 96h 的时间点作为 LC50的计算时间点。其主要原因既是时间越长，重金属毒性对生物的致死效应越强，死亡曲线趋势越明显。依据有毒物质对水生生物毒性标准重金属砷
