1、毕业论文 文客久久 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 水产品中喹乙醇残留量的测定 学 院： 学生姓名： 专 业： 农业资源与环境 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 文客久久 目录 中文摘要 1 英文摘要 2 1.前言 3 2.喹乙醇的简介 3 2.1 喹乙醇的结构和作用机理 3 2.2 喹乙醇的毒性和危害 4 2.3 喹乙醇的检测方法 4 3.高效液相色谱法 4 3.1 材料和方法 4 3.2 结果和分析 5 4.超高效液相色谱 -串联质谱法 9 4.1 原理 9 4.2 材料与方法 9 4.3 结果和分析 11 5.结论 19 致谢 20 参考文献 21 毕业论文 文客久久
2、 水产品中喹乙醇残留量的测定 摘要 在动物组织中 3-甲基喹噁啉 -2-羧酸（ MQCA）是喹乙醇的主要检测最终代谢物。针对喹乙醇的标示残留物 MQCA，本文 通过研究建立了水产品中喹乙醇残留量的高效液相色谱法以及超高效液相色谱 -串联质谱检测法。 样品组织在盐酸溶液中水解，样品水解液用MAX 固相萃取柱净化，用 高效液相色谱法和超高压液相色谱 -串联质谱检测法 分别 进行定量分析。 本文 建立 并比较 了水产品中 MQCA 的两种 快速、灵敏的检测方法。 高效液相色谱法在 4.0 g /kg200 g /kg 的添加范围内的平均回收率为 89.4%93.0%，相对标准偏差 5%，方法检出限为
3、 4.0g /kg。超高压液相色谱 -串联质谱检测法 在 0.25g /kg 50.0g /kg 之间 ，从 94.6104.2%。相对标准偏差值 6%， 方法检出限为 0.1g /kg。 关键词 喹乙醇 3-甲基喹噁啉 -2-羧酸 水产品 毕业论文 文客久久 Residue determination of olaquindox in aquatic products Abstract Methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid(MQCA) is the last major remaining detectable metabolite of Olaqui
4、ndox in animal tissue. This article established HPLC and UPLC -MS/MS methods for the determination of MQCA.The fish samples were s extracted by hydrochloric acid hydrolysis, then purified by Oasis MAX solid-phase extraction, at last quantitative analysised by HPLC and UPLC -MS/MS. Two rapid and sens
5、itive methods were developed and compared for the determination and quantification of MQCA in aquatic products. The recoveries for MQCA at the addition of 4.0-200 g/kg were ranged from 89.4% to 93.0% and the relative standard deviation (RSD) for the determination of MQCA was less than 5% by HPLC.And
6、 the limit of quantity (LOQ ) was 4.0 g/kg The recoveries for MQCA at the addition of 0.25-50.0 g/kg were ranged from 94.6% to 104.2% and the relative standard deviation (RSD) for the determination of MQCA was less than 6% by UPLC -MS/MS.And the limit of quantity (LOQ ) was 0.1g/kg Key words Olaquin
7、dox Methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid(MQCA) aquatic products 毕业论文 文客久久 水产品中喹乙醇残留量的测定 1 前言 水产养殖是我国国民经济的重要组成部分 ，为国民经济建设和人民生活水平提高做出了重要贡献，但随着养殖业的迅猛发展，食用水产品质量等问题迅速暴露出来，水产养殖中存在水体污染与滥用各种渔药与添加剂等情况，使水产品质量问题日益凸显，水产品安全成为捆饶人类并亟待解决的问题并引起当今社会各界的广泛关注。近年来，广东、四川、江苏、江西、山东、北京、天津等地发现一种 “ 鱼类应激性出血腹水综合症 ” ，即许多养殖商品鱼在运
8、输过程中发生不同程度的死亡情况，而且呈现越来越严重的趋势，给许多养殖户带来巨大的经济损失。其主要原因之一是长期使用喹乙醇造成的鱼中毒。喹乙醇具有良好 的广谱抗菌及促进生长作用，而被广泛用于鱼药、添加剂及饲料当中，但因其在鱼体内长时间残留，且具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，不仅对水生动物的健康造成威胁，也会对食用这些水生动物的人们造成影响 1。因此 必须 充分认识喹乙醇毒性和在鱼体内的残留和危害，提高养殖者和经营者的素质和从业水平，加强宣传和监管力度，严格把关生产、销售和使用各个环节，严禁使用含有喹乙醇的配合饲料喂鱼。 2 喹乙醇的简介 2.1 喹乙醇结构和作用机理 喹乙醇 (O
9、laquindox)是 1965 年由德国拜耳公司以邻硝基苯胺为原料 合成的一种抗菌促生长剂， 20 世纪 70 年代起，欧盟、澳大利亚、日本、中国等陆续批准该药作为饲料添加剂使用。喹乙醇又称倍育诺、快育诺、喹酰胺醇，属于喹噁啉类。喹乙醇促进生长的原理是通过抵制有害菌生长，影响动物体内特别是内分泌系统的营养物质代谢，促进营养物质的吸收及营养物质（尤其是蛋白质）的沉积，促进合成，提高饲料中能量和氮的利用率，提高饲料转化率，从而促进鱼虾的生长 2。但近些年来，很多学者对喹乙醇的毒性重新做了深入系列的研究与评价，认为它是一种基因毒剂和生殖诱变剂，有致突变、致畸作用，畜禽产品中残留的喹乙醇 可致染色体
10、断裂，能诱发机体出现细胞突变等 3。喹乙醇分子式 为 C12H13N3O4， 相对分子量为 191， 结构式见图 2-1 A，对光敏感，光照易分解为棕色，人接触后易引起皮肤光敏反应 4。 喹乙醇本身不稳定，在动物体内能够在短时间内代谢。其在动物体内有十多种代谢产物，其中 3-甲基喹噁啉-2-羧酸（ MQCA）是主要代谢物，在体内相对稳定，是 喹乙醇 的标示残留物之一 5，如图 2-1 B 所示。 图 2-1 喹乙醇 (A)与 MQCA(B)结构式 Fig.2-1The Structure of Olaquindo (A) and MQCA (B) 2.2 喹乙醇的毒性和危害 喹乙醇的毒性从六个
11、方面进行研究，分别是急性毒性，蓄积毒性，亚慢性毒性，致突变毕业论文 文客久久 毒性，免疫毒性以及生态毒性。 喹乙醇是一种曾在畜禽及水产养殖中广泛使用的抗菌促生长剂，使用不当或过量使用都会对生态环境构成潜在危害。喹乙醇 的急性 毒性在鱼类 里 敏感性较低 ， 有中度的蓄积毒性。 喹乙醇作用于动物后会严重损害动物肝肾组织，引起机体生理生化指标的 变化。 而在免疫毒性方面， 喹乙醇可能会抑制哺乳动物机体的红细胞免疫功能，致使免疫机能下降。喹乙醇 还会 抑制骨髓的造血机能，导致其贫血 ，甚至 引起动物早期胚胎死亡。 喹乙醇作为饲料添加剂，使用过量时会造成动物急性中毒。中毒鱼头部发黑，有时会全身性出血
12、， 头部、腹部、鳃、鳍条等明显充血，体表粘液少，粗糙不光滑。长期用喹乙醇饲喂动物，会有累计中毒趋势。已中毒或在体内蓄积大量喹乙醇但未表现中毒症状的动物若被人食用，则可造成喹乙醇在人体内的蓄积，从而危害人体健康。因此，喹乙醇已被列入无公害食品禁用鱼药表，并且在无公害食品水产 品中鱼药残留限量表中明确标明不得检出 6。 2.3 喹乙醇的检测方法 喹乙醇本身不稳定，在动物体内能够在短时间内代谢。其在动物体内有十多种代谢产物，其中 3-甲基喹噁啉 -2-羧酸（ MQCA）是主要代谢物，在体内相对稳定，是 喹乙醇 的标示残留物之一。 目前国内外 通常将喹乙醇代谢物 MQCA 作为残留分析和监控的目标物
13、， 因此迫切需要对水产品中喹乙醇 标示残留物 MQCA 的测定方法进行研究。目前文献报道的 MQCA残留分析可以采用液相色谱法 7、液相色谱 -串联质谱法 8、纳米胶体金探针法 9分析测定。为了快速、准 确的测定水产品中喹乙醇残留量，本文采用高效液相色谱和超高效液相色谱 -串联质谱仪作为分析手段，建立灵敏度高、快速准确的测定方法。 3 高效液相色谱法 3.1 材料与方法 3.1.1 材料与试剂 实验所用水产品均购自舟山农贸市场，按照相关规定处理后作为检测样品。 实验用水为 Milli-Q 制备高纯水；甲醇，甲酸，乙酸乙酯：色谱纯， MERK 公司； MQCA标准品：纯度大于 98%，德国 Dr
14、 公司 ；其他试剂均为分析纯。 3.1.2 仪器与设备 Alliance 2695 高效液相色谱仪带紫外检测器，美国 waters 公司 ； IKAT18 基本型组织捣碎机，德国 IKA 公司 ； MS2 漩涡振荡器，德国 IKA 公司 ； Centrifuge5810 台式高速离心机，德国 Eppendorf 公司 ； N-EVAP112 氮吹仪， Organomation 公司 ； AL204 型电子天平，瑞士梅特勒 -托利多仪器有限公司 ； SHA-B 水浴恒温振荡器，江苏亿通电子有限公司 ； SL-502N型台式天平，上海华岩设备仪器有限公司 ； 60 mg/3mL MAX 阴离子交换
15、固相萃取柱，美国Waters 公司。 3.1.3 实验方法 毕业论文 文客久久 3.1.3.1 试样提取 精密称取解冻 均质的样品 5.00 0.02g 置于 50mL 聚丙烯 离心管中，加入 2mol/L 盐酸 溶液 15mL，匀浆 提取 5min， 拧上盖子漩涡混合振荡 2min， 振荡水浴 60min。酸水解后， 8000 r/min 离心 10 min， 滤纸过滤 收集上清液 ， 转移到另一个 50mL 聚丙烯 离心管中备用。 3.1.3.2 净化 MAX 固相萃取柱依次用 3mL 甲醇、 3mL 水活化，待 MAX 固相萃取柱里的活化液都流尽后 ，加入 之前备用的 提取液，控制流速，
16、待样 品提取 液全部流出后 再 用 3mL 淋洗液（ 0.05mol/L 乙酸钠溶液：甲醇 =90:10， VA/VB） 淋 洗固相萃取柱，待 3mL 淋洗液 全部流出后抽 近干 。最后用 3mL 含 2%甲酸 -乙酸乙酯溶液 (甲酸：乙酸乙酯 =2:98, VA/VB)洗脱， 用 15mL聚丙烯 离心管在固相萃取柱下收集。 洗脱液在 40 下氮气吹干，加 1ml 1%甲酸水溶液 -甲醇（ 60： 40） 溶液 充分 溶解残渣，漩涡混匀 1min，过 0.45m 有机相 滤膜后 上机 待测。 3.1.3.3 色谱条件 色谱柱： Sunfire C18 柱（ 250mm4.6 mm， 5m）。柱
17、温： 30 。流动相： 1%甲酸水溶液 -甲醇（ 1%甲酸水 溶液：甲醇 =60:40， VA/VB）。 流速 ： 1.0mL/min。进样量： 50L。 检测器：紫外检测器。 检测波长： 320 nm。 3.1.3.4 标准 溶液配制 MQCA 标准储备液：准确称取 10 mg 的标准品，用甲醇溶解并定容于 100mL 棕色容量瓶，配成标准储备液，浓度为 100 mg/L。 MQCA 标准工作液：用流动相将标准溶液逐级稀释成 20g/L、 50g/L、 250g/L、 500g/L、 1000g/L 系列标准工作液。 3.1.3.5 标准曲线 分别取系列 MQCA 标准 工作 液按从 低 到
18、大 高的 顺序 高效液相色谱测定后绘制标准曲线。 样品测定根据保 留时间定性，外标峰面积定量。 3.1.3.6 回收率和精密度 取样品 5.0g，加入相当于样品含量 4g/kg、 40g/kg 的 MQCA 标准溶液，每个水平做 6个平行， 按上述方法进行前处理和上机分析 测定 MQCA 含量，计算回收率和相对标准偏差。 3.2 结果与分析 3.2.1 前处理方法选择 测定水产品中喹乙醇标示性残留物 MQCA 的残留量，样品的前处理是非常重要的，其处理方法的好坏，是否具有可操作性，将直接关系到检测方法的准确度及检出限。由于MQCA 残留在动物组织，普通方法难 以 将 目标物 提取完全，且会带入
19、大量蛋白质 、 色素等其它 杂质，影响 MQCA 的 提取 、 分离效果 。 有研究表明可以利用酸水解、碱水解 10和酶解毕业论文 文客久久 11等方法使 MQCA 与肌肉组织分离，形成游离态的 MQCA，达到 充分 提取的目的。碱水解通常反应较为剧烈，会造成少量 MQCA 降解，且反应后需要调节 pH 至酸性。酶解条件比较温和，但需要 较 长的反应时间（ 16 小时以上） ，回收率很低 12。本 实验 采用盐酸水解方法，研究不同盐酸浓度 下 的 MQCA 的分离提取 效果。采用阳性草鱼样品进行水解实验，以实 验所 测 到的样品回收率反映各浓度下样品的提取 效果，其结果如图 3-1 所示。结果
20、表明，样 品组织用 2mol/L 盐酸溶液水解 60 min， 可有效从肌肉组织分离 出 MQCA，形成游离态的MQCA。 本实验 方法与氢氧化钠碱水解相比，盐酸水解条件较为温和，可 减少 MQCA 降解，减少提取液中杂质成分 ， 提高净化效果，提高方法回收率。 0204060801000 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5盐酸浓度回收率图 3-1 不同盐酸浓度下样品的提取效果 Fig.3-1 The extract effect of different concentration of hydrochloric acid samples 3.2.2 色谱条件的优化 3.2.2.1
21、色谱柱的选择 实验对 ZORBAX SB-C18 柱（ 250 mm 4.6 mm， 5m）、 Sunfire（ 250 mm 4.6 mm，5m）、 X- Bridge（ 250 mm 4.6 mm， 5m）等 3 种 C18 色谱柱进行选择， ZORBAX 和 X-Bridge C18 色谱柱出峰较早，但有杂峰干扰， Sunfire C18 色谱柱 虽 出峰相对较晚，但分离效果好，因此选择 Sunfire C18 色谱柱作为 MQCA 分析柱。 3.2.2.2 流动相 分析 MQCA 常用的流动相为 0.5%甲酸水溶液 -甲醇（ 70： 30），甲醇、水和乙酸 -乙酸钠缓 冲液组成梯度洗脱
22、以及 1%甲酸水溶液 -甲醇（ 60： 40）。经 实 验比较，以 1%甲酸水溶液-甲醇（ 60： 40）作为流动相，其峰形和灵敏度为最好。 MQCA 标准溶液的高效液相色谱图如图 3 所示，样品空白色谱图、样品加标色谱图如图 3-2图 3-5 所示。 MQCA 色谱峰峰形尖锐，对称性好，与杂质完全分离，可满足定量分析的要求。 毕业论文 文客久久 图 3-2 50g/LMQCA 标准溶液色谱图 Fig.3-2 HPLC chromatogram of MQCA standard solution (50g/L) 图 3-3 空白样 品色谱图 Fig.3-3 HPLC chromatogram
23、of blank sample 毕业论文 文客久久 图 3-4 样品 4g/kg MQCA 加标色谱图 Fig.3-4 HPLC chromatogram of blank sample spiked with MQCA standard (4g/kg) 图 3-5 样品 40g/kg MQCA 加标色谱图 Fig.3-5 HPLC chromatogram of blank sample spiked with MQCA standard (40g/kg) 3.2.3 线性范围和检出限 用 MQCA 标准使用液配制浓度分别为 20、 50、 250、 500、 1000g/L 的标准工作溶液，进样后制作标准曲线。方法在 4.0-200g/L 范围内方法线性良好，线性相关系数为 0.9994。
