1、 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 氯化铵对日本沼虾存活、耗氧率及抗氧化酶活力的影响 学 院： 学生姓名： 专 业： 水产养殖 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 目录 中文摘要 . 1 英文摘要 . 1 1. 前言 . 1 2. 实验材料 . 2 2.1 日本沼虾 . 2 2.2 主要实验仪器 . 2 2.3 抗氧化酶活力测定试剂盒 . 3 2.4 实验用水 . 3 3. 实验方法 . 3 3.1 氯化铵对日本沼虾急性毒性实验 . 3 3.2 氯化铵对日本沼虾呼吸耗氧率的影响实验 . 3 3.3 氯化铵对日本沼虾鳃组织抗氧化酶（ CAT、 GSH）活力的影响实验 . 3 4数据处理 .
2、 3 5实验结果 . 4 5.1 氯化铵对日本沼虾急性毒性 . 4 5.2 氯化铵对日本沼虾呼吸耗氧率的影响 . 5 5.3 氯化铵对日本沼虾鳃组织抗氧化酶（ CAT、 GSH）活力的影响 . 5 6.讨论 . 7 6.1 日本沼虾对氯化铵的耐受响应特征 . 7 6.2 日本沼虾的氯化铵安全浓度的确定 . 8 小结 . 8 致谢 . 9 参考文献 . 10 1 氯化铵对日本沼虾存活、耗氧率及抗氧化酶活力的影响 摘要 本实验主要进行的是氯化铵对日本沼虾耐受程度和响应特征的研究，经过对实验眼界结果的处理分析，主要得到以下几点：（ 1） NH4Cl 对日本沼虾在实验周期（ 24h、 48h、 72h
3、、96h）内的的半致死浓度分别为 37.014 0.361mg L-1、 13.209 0.361 mg L-1， 7.038 0.360 mg L-1、 4.712 0.340 mg L-1；（ 2） NH4Cl 胁迫会明显影响到日本沼虾的呼吸耗氧率，实验设定内的 NH4 Cl 质量浓度为 0.157 mg L-1 0.785 mg L-1，这些组中，日本沼虾的日均呼吸耗氧率和夜均呼吸耗氧率均显著高于空白组； NH4 Cl 质量浓度为 2.000 mg L-1 的实验组中，日本沼虾的日均呼吸耗氧率和夜均呼吸耗氧率都明显比空白组的低；（ 3）当 NH4 Cl 质量浓度小于等于 0.471 mg
4、 L-1 时，日本沼虾抗氧化酶（ CAT、 GSH）活力在实验周期内都高于对照组，而 NH4 Cl 质量浓度 高于 0.471 mg.L-1 的实验组，当实验周期进行至 96h 时，日本沼虾的抗氧化酶（ CAT、 GSH）活力均低于对照组。 关键词 日本沼虾 氯化铵 耗氧率 半致死浓度 耐受特征 1 Ammonium chloride the nipponense survival, oxygen consumption rate and antioxidant enzyme activity in ABSTRACT Tolerance and response of Macrobrachiu
5、m nipponense to NH4Cl concentration were studied. Acute semistatic toxicity tests were carried out for 96h with Macrobrachium nipponense. SC（ safe concentration） and LC50（ half lethal concentration） indiced for NH4Cl were determined. The result indicated that：（ 1） The LC50-24h， LC50-48h， LC50-72h， a
6、nd LC50-96h values in this study were 37.0140.361mg L-1、 13.209 0.361mg L-1、 7.038 0.360mg L-1、 4.712 0.340mg L-1， respectively. The SC-96h value were 0.4712 0.0340mg L-1.（ 2） When the NH4Cl concentrations were higher than 0.157mg L-1 but lower than 0.785mg L-1 the average oxygen consumption rate of
7、 the Macrobrachium nipponense in daying or that in night were significantly higher（ P0.05） than control group， while significantly lower than control group when the NH4Cl concentration is 2.000mg L-1.（ 3） The GSH and CAT activity in gills of Macrobrachium nipponense of groups that the NH4Cl concentr
8、ations were lower than 0.471mg L-1 was higher than control group during 96 hours， while that of the other groups was lower than the control group at last. KEYWORDS: Macrobrachium nipponense pH NH4Cl Tolerance Response 1 氯化铵对日本沼虾存活、耗氧率及抗氧化酶活力的影响 1. 前言 虾类隶属于节肢动物门，它分布广泛，有近 2000 种，是一种世界性的养殖品种。虾类养殖虽然产量不能
9、和鱼类、贝类相比，但产值较高，属于名、特、优产品，因此在我国水产养殖中占有重要地位。虾类在整个 生活史过程中都受到其所生活的水环境中生物因子和非生物因子的影响，而对于此有机体往往采取从个体、组织到分子水平的一系列适应性调整，以适应或提高其在变化了的环境条件下的存活和生长的需要 5。在自然和养殖条件下，由于环境的时刻变化（周期性、季节性和人为的波动），虾类通过自身一系列机制调整其生理和生态的适应性 6以适应环境胁迫带来的影响，对于鱼类、贝类的逆境生态学研究已有大量报道，相对于鱼类和贝类，虾类的生活史特殊（蜕皮现象），从而更加引起了研究者们的兴趣。 虾类逆境生态学的研究作为其生理生态学的重要研究内
10、容， 已为揭示虾类在逆境胁迫下机体自身一系列的生理和生态适应特性提供了重要依据，无疑为虾类的养殖生产作出了重要贡献。本文就逆境生态因子胁迫下虾类的耐受与响应特征的研究做一综述。 日 本沼虾在世界上的地理分布较狭窄，仅限于日本和我国。在我国，日本沼虾广泛分布于南北各地的江河湖泊中，也常出现在低盐度的河口地带。特别是在江苏太湖、河北白洋淀、山东微山湖等处的日本沼虾最为著名。日本沼虾是我国淡水虾类中 个体 较大的一种，其适应性 较强、分布 比较 广 泛 ，但自然水域中的资源量较为有限，因其具有食性杂、养殖周期短、繁殖能力强、肉质细嫩等 特点， 是目前我国淡水养殖业中重要的养殖对象和最有发展前途的品种
11、之一。此外，日本沼虾作为其生存环境的食物链中鱼类的饵料生物也有重要意义，可见日本沼虾具有极高的经济价值和生态学地位，有着广阔的增养殖开发和研究前景。 我 国 的淡水虾类养殖品种主要有日本沼虾和罗氏沼虾 （ Macrobrachium rose-nbergii）。 日本沼虾 肉的蛋白质含量介于对虾与罗氏沼虾之间，除色氨酸外人体其余的 7 种必需氨基酸含量，均高于对虾和罗氏沼虾 2，因此日本沼虾养殖在我国 淡水 虾类养殖业中占有重要位置。 为此，有必要首先通过了解日本沼 虾生物学特性和养殖现状，进而对其进行系统的研究，以达到科学养殖的目的。 由于水生生物生活史和生存环境的差异，如虾蟹类在生活史中出
12、现蜕皮现象，使得水生生物在其生长、繁殖、行为等方面对于逆境生态因子的适应出现不同表征形式，因此有必要研究水生生物逆境生态学来了解其生物特性，同时也可为有助于指导渔业资源管理，还有助于养殖生产技术的提高以及养殖水域环境的调控和保护，因此具有重要的理论意义和现实意义。 本实验主要的主要任务是研究日本沼虾对氯化铵的耐受程度及特征的响应。经实验的相关测定和分析，顺利完成了实验，并取得了一些结 果。氨化作用是养殖水域中微生物作用的重要途径，而氨氮则是评价水质优劣的重要指标及引发养殖生物疾病的重要因子。所以，确保生物的2 正常生长、发育和繁殖的关键则在于有效控制养殖水体的氨氮水平。而且，控制好养殖水体氨氮
13、平衡是促进水产养殖业的健康可持续发展的基础和前提。 氨氮对水产养殖生物的危害已引起了全球水产养殖学界的普遍广泛关注和高度重视。同时，国内外已针对氨氮对中华绒螯蟹幼体、罗氏沼虾幼、中国对虾、斑节对虾、文蛤、黄颡鱼等许多水产养殖动物进行了生态毒理学的相关探讨和深入研究，相比之下，却很少有较为独到和新颖的关 于氨氮对日本沼虾的急性毒性等病理学的的研究报道。因此，进行这样一项研究实验对于认识和了解氯化铵对日本沼虾的影响具有科学价值和研究意义。该实验主要分五阶段进行开展：第一，是相关文献的收集和整理；第二，是预备实验的探索；第三，是正式实验的展开；第四，是实验结果的处理；第五，是总结实验结论。其中，主要
14、包括对日本沼虾氯化铵对日本沼虾的急性毒性实验、耗氧率的影响以及对抗氧化酶活力的测定。通过该实验的研究和分析总结，主要是想为日本沼虾的安全高效生产和生态科学养殖提供更稳定更安全更可靠的水产养殖的生态环境。 2. 实验 材料 2.1 日本沼虾 所用日本沼虾购于余姚市青港野生苗种厂，运回实验室后，暂养于规格为 70cm 48cm37cm 的水箱中，连续充气，不投食，及时捞出死亡个体，每 24h 换水一次。待其排空粪便后随即选取规格相近，肢体完好、健壮有活力且体色接近的非抱卵日本沼虾作为实验对象，规格为：体长（ 4.29 0.32） cm、体重（ 1.80 0.12)g。 2.2 主要实验仪器 规格为
15、 55cm 40cm 30cm 和 80cm 50cm 42cm 的塑料箱； JPSJ-605 台式溶解氧测定仪； pH 计； Sartorius BP211D 电子天平； 722S 可见分光光度计； Anke TDL-40B 台式离心机；ATINAN 加热棒； UPWS 纯水机。 如图 1 所示，仿照黄玉瑶等（ 1975）的流水密封装置设计日本沼虾呼吸耗氧率的测定系统，其中 A 为水塔， G 为虹吸管， L 为流量控制开关， C 为呼吸室（规格 30cm 30cm 12cm）， D为恒温水槽， I 为已耗氧水暂存瓶， E 为出水槽， F 为玻璃管。 图 1 日本沼虾呼吸耗氧率测定装置 Fig
16、ure 1 Macrobrachium respiration rate measurement device 3 2.3 抗氧化酶活力测定试剂盒 CAT 活力测定试剂盒（可见光法）、 GSH 酶活力测定用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，测定日本沼虾抗氧化酶（ CAT、 GSH）活力。 2.4 实验用水 实验基础水为经 48h 曝气的自来水，水温 24 0.2， OD 值 7.24 0.14mg L-1， pH7.11 0.07，水质符合 NY5051-2001 无公害食品淡水养殖用水水质标准（中华人民共和国农业部，2001)，适量的 1g L-的 NH4Cl（国药集团化学试剂有限公司生产
17、）母液调配成不同 NH4Cl 浓度的实验水。 3. 实验方法 3.1 NH4Cl 对日本沼虾急性毒性实验 经预备实验，确定 NH4Cl 对日本沼虾急性毒性的实验质量浓度范围（ 96h 全活浓度下限和全死浓度上限），按等对数间距法设置 0.000mg L-1、 4.000mg L-1、 7.000mg L-1、11.000mg L-1、 17.000mg L-1、 28.000mg L-1等 6 个 NH4Cl 质量浓度梯度组，以规格为 55cm 40cm 30cm 的塑料箱为实验单元，每单元盛实验水 20L，实验时随机挑选 10 尾日本沼虾放入实验容器单元中，每个梯度 3 个重复，采用静水停食
18、法开 展 NH4Cl 对日本沼虾的 96h 急性毒性效应实验。实验周期为 96h，每 24h 换一次水；连续观察虾的活动状况，以用玻璃棒触碰虾体无反应作为死亡的标准，随时捞出死虾并记录死亡现象和死亡数量。 3.2 NH4Cl 对日本沼虾呼吸耗氧率的影响实验 据 NH4Cl 对日本沼虾的急性毒性实验结果，以自然状态为对照组，按等差间距法设置0.157mg L-1、 0.314mg L-1、 0.471mg L-1、 0.628mg L-1、 0.785mg L-1、 0.942mg L-1、2.000mg L-1（ 96 全活浓度下限）等 8 个质量浓 度梯度，每梯度重复 3 次，采用流水呼吸室
19、法（单位时间水流量为 4.32 0.67L h-1)开展对日本沼虾昼夜耗氧率的影响实验。实验前同时随机选取 4 尾实验虾放入对应的呼吸室内，稳定 1h 后，于翌日 0:00 起每隔 1次测定呼吸室流入水与流出水的水温和 DO 值，连续测定 24h。实验期间保持 pH 值恒定。实验结束后，用滤纸吸净对应的呼吸室内实验虾体表水分并称其体重。 3.3 NH4Cl 对日本沼虾鳃组织抗氧化酶（ CAT、 GSH）活力的影响实验 以自然状态为对照组，按等差间距法设置 0.157mg L-1、 0.314mg L-1、 0.471mg L-1、0.628mg L-1、 0.785mg L-1、 0.942m
20、g L-1、 2.000mg L-1等 8 个质量浓度梯度，每梯度重复 3次，测定日本沼虾鳃组织的 CAT 活力和 GSH 活力 。 于实验第 24h、 48h、 72h、 96h 分别取样一次，每次每实验单元各随机取实验虾 3 尾，于并盘上解剖取其鳃组织并准确称重，用玻璃匀浆器充分研磨后，用 0.86%的生理盐水制成 10%的组织匀浆液， 4保存备测。按照 CAT、 GSH 测试盒的测定方法将组织匀浆液稀释至相应浓度后进行测定。 4数据处理 4 呼吸耗氧率（ mg g-1 h-1） =（ DO1 DO2） V/W 式中： DO1、 DO2分别指进水口、出水口溶氧量（ mg L-1）， V 指
21、单位时间流量（ L h-1）， W指同一呼吸室中所有实验对象体重之和（ g）。 CAT 活力、 GSH 活力的计算方法按照南京建成生物工程研究所生产的酶活力测试试剂盒的方法进行测定。 根据 NH4Cl 对日本沼虾急性毒性实验的结果，建立不同观察时段死亡概率单位 质量浓度对数直线回归方程。 NH4Cl 对日本沼虾的安全浓度计算公式如下： SC=0.1 96hLC50 所得数据运用 SPSS17.0 经统计学分析，并利用 LSD 法进行差异性比较，显著水平为P0.05。 5实验结果 5.1 NH4Cl 对日本沼虾急性毒性 由表 1 可见，同一时段内实验对象的死亡率随 NH4Cl 质量浓度的增高而增
22、高，同一实验质量浓度梯度内实验对象的死亡率随时间的延长而增高，表现出明显的计量效应和时间效应。对表 1 结果作统计学处理得表 2。由表 2 可见， NH4Cl 对日本沼虾 24h、 48h、 72h、 96h 的半致死浓度分别为 37.014 0.361mg L-1、 13.209 0.361mg L-1、 7.038 0.360mg L-1、 4.7120.340mg L-1。观察发现，死亡个体肌肉和鳃组织发白，内脏松散呈流质状。 表 1 NH4Cl 对日本沼虾急性毒性 Table 1 of NH4Cl on the acute toxicity of nipponense 表 2 不同观察
23、时段 NH4Cl 对日本沼虾的急性毒性特征的分析 Table 2 Analysis of the different observation periods NH4Cl on the acute toxicity characteristics of the Japanese marsh shrimp 时间 概率单位 -质量浓度 回归方程 R2 df F Sig LC50 /mg.L-1 SC /mg.L-1 浓度 / mgL-1 死亡率 /% 24h 48h 72h 96h 0 0 0 0 0 4 13 30 43 47 7 20 36 47 63 11 27 43 57 77 17 37
24、50 63 87 28 43 70 80 97 5 24 h Y = 1.155x + 3.189 0.998 4 480.375 0.000 37.014 0.361 0.471 0.034 48 h Y =1.163x + 3.696 0.922 4 35.514 0.009 13.209 0.361 72 h Y =1.173x + 4.006 0.915 4 32.180 0.010 7.038 0.360 96 h Y =2.122x + 3.572 0.990 4 292.951 0.000 4.712 0.340 5.2 NH4Cl 对日本沼虾呼吸耗氧率的影响 如表 3 所示，各
25、 NH4Cl 质量浓度梯度组中，日本沼虾的 日呼吸耗氧率都显著低于夜呼吸耗氧率（ P0.05）。同时可见， NH4Cl 的质量浓度为 0.157mg L-1、 0.314mg L-1、 0.471mg L-1、0.628mg L-1、 0.785mg L-1五个实验组的日呼吸耗氧率和夜呼吸耗氧率也明显比对照组（ P0.05）高； 0.942mg L-1这一实验组中，日呼吸耗氧率与对照组没有显著的差异，但夜呼吸耗氧率却显著低于对照组（ P0.05）； 2.000mg L-1实验组相对于对照组（ P0.05），其日呼吸耗氧率和夜呼吸耗氧率都偏低。 表 3 NH4Cl 对日本沼虾呼吸耗氧率的影响 T
26、able 3 of NH4Cl on the respiration rate of nipponense 注： x、 y 代表同一行间的差异； w、 v 表示同一列间的差异；不同字母表差异性（ P0.05） 5.3 NH4Cl 对日本沼虾鳃组织抗氧化酶 （ CAT、 GSH） 活力的影响 NH4Cl 浓度 / mg L-1 呼吸耗氧率 / mg g-1 h-1 日均呼吸耗氧率 夜均呼吸耗氧率 0 0.295xw 0.453yw 0.157 0.397xv 0.555yv 0.314 0.433xv 0.612yv 0.471 0.460xv 0.661yv 0.628 0.564xv 0.8
27、32yv 0.785 0.331xv 0.517yv 0.942 0.293xw 0.395yv 2.000 0.253xv 0.347yv 6 如图 2 可知，在实验周期内，当 NH4Cl 质量浓度小于等于 0.471mg L-1时，日本沼虾鳃组织Cat 的活力均比对照组高； NH4Cl 质量浓度为 0.628mg L-1、 0.785mg L-1的两个实验组在实验周期内会呈现不同的变化阶段：在 24h、 48hCAT 的活力高于对照组，到 72h 时与对照组相均衡，而在 96h 时开始低于对照组； 0.942mg L-1、 2.000mg L-1两实验组别的鳃组织 CAT 活力也出现周期时
28、段变化： 24h 时高于对照组， 48h 同对照组持平， 72h、 96h 都比对照组低。 如图 2 所示， GSH 活力则在 24h 达到最大值，各个实验组均有这一特点；到 48h 都开始出现不同幅度的下降趋势，除 0.785mg L-1的实验组之外；在 48h 时，质量浓度在 0.942mg L-1、2.000mg L-1两实验组别中 GSH 的活力下降程度大于 0.785mg L-1的实验组；当实验周期达到72h 时， 0.785mg L-1的实验组的 GSH 活力才开始大幅度的下降，并最终保持稳定状态。 图 2 NH4Cl 对日本沼虾鳃组织 GSH 活力的影响 Figure 2 of NH4Cl vitality of the Japanese marsh shrimp gill tissue GSH
