1、 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 血卵涡鞭虫感染对三疣梭子蟹非特异性免疫指标的影响 学 院： 学生姓名： 专 业： 水产养殖 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 目录 中文摘要 . 1 英文摘要 . 2 1. 前言 . 4 1.1 三疣梭子蟹的养殖状况 . 4 1.2 三疣梭子蟹养殖出现的问题 . 4 1.3 血卵涡鞭虫的感染状况 . 4 1.4 甲壳动物免疫防御机制 . 4 2. 材料与方法 . 5 2.1 试验材料 . 5 2.2 试验方法 . 5 3. 试验结果 . 6 3.1 血卵涡鞭虫感染三疣梭子蟹及健康梭子蟹非特异性免疫指标对比 . 7 3.2 注射台盼蓝染色血卵涡鞭虫虫体
2、对梭子蟹血淋巴的影响 . 8 4. 结论 . 10 致谢 . 11 参考文献 . 12 1 血卵涡鞭虫感染对三疣梭子蟹非特异性免疫指标的影响 摘要 试验用血卵涡鞭虫感染梭子蟹样本均于 2011 年 8 月采集于舟山市朱家尖某梭子蟹养殖塘（见图 1），采集疑似雄性感染样本共 48 只（ 22.33.8g）；健康蟹采集于临近养殖塘，共采集雄性样本 20 只（ 24.64.3g）。疑似感染样本及健康蟹均采用 显微镜检及 PCR 诊断筛选，分组后采样分析；试验用注射感染样本捕捞于浙江省海洋水产研究所西轩岛试验场梭子蟹养殖塘，雄性 30 只 (121g16g)，平均分为 6 组，以充氧机充气暂养于 10
3、0L 的塑料桶中。经显微初筛及 PCR 诊断确认，从 50 个疑似样本中选取 10 个严重感染样本作为血卵涡鞭虫感染组，从 20 个健康样本中随机选取 10 个样本作为健康梭子蟹对照，两组间体重差异不显著。感染样本与健康样本表观差异（图 2）：感染血卵涡鞭虫的梭子蟹普遍活动能力较弱，血淋巴颜色呈白浊状，凝固能力较差，显微镜下可见大量的与梭子蟹血细胞大小类 似的血卵涡鞭虫，而健康梭子蟹则活力较强，血淋巴为稍带蓝色，血淋巴在体外一分钟即可凝固。血卵涡鞭虫感染三疣梭子蟹及健康梭子蟹非特异性免疫指标对比见表 1由表 1可见发现感染血卵涡鞭虫后，梭子蟹血细胞大幅减少（图 3），有的样本血细胞数几乎不可检
4、出，而健康梭子蟹血细胞数在（ 276324541） 103cells/mL，差异极显著（ P0.01）。本研究注射的虫体经灭活处理，可能已经改变其表面抗原结构，但是梭子蟹免疫防御系统能迅速识别并响应，但是在自然感染的某些蟹鳃小片上也发现了很多类似的包裹团结构，说明有部分血卵涡 鞭虫被血细胞识别并进行包裹清除，但是还是有很大一部分血卵涡鞭虫未能被成功清除。即在自然感染状态下，似乎这种免疫防御机制对有些活的血卵涡鞭虫失去了作用，推测活体血卵涡鞭虫抗原可能存在某种特殊机制躲避梭子蟹的免疫系统进而大量繁殖导致梭子蟹的死亡，这有待进一步研究证实。 关键字 三疣梭子蟹 感染 血卵涡鞭虫 2 Blood e
5、ggs vortex whipworm infection Portunus trituberculatus non-specific immune indicators Abstract Test blood eggs vortex whipworm infection the Portunus samples Zhujiajian a swimming crab aquaculture ponds (see Figure 1) were collected in August 2011, collecting a total of 48 suspected male infection s
6、amples (22.3 3.8g); health crab collected near the breeding pond, were collected from 20 male samples (24.6 4.3g). Suspected of being infected samples and healthy crab both microscopy and PCR diagnostic screening, packet sampling and analysis; test injection fishing samples of infection in the Marin
7、e Fisheries Research Institute of Zhejiang Province West Xuan Island proving ground swimming crab aquaculture ponds, 30 male (121g 16g) , divided into six groups, oxygenation machine, inflatable holding 100L plastic barrels. Confirmed by microscopic screening and PCR diagnosis, 10 serious infections
8、 samples selected from the 50 suspected samples of blood eggs vortex whipworm infection control as a health Portunus randomly selected 10 samples from 20 healthy samples, between the two groups The weight difference was not significant. Infected samples and healthy samples apparent differences (Figu
9、re 2): Blood eggs vortex whipworm infection Portunus general activity is weak, the hemolymph color was whitish-like solidification poor, visible under the microscope a large number of similar and the size of the swimming crab blood cells blood the eggs eddy whipworm, and healthy swimming crab strong
10、 vitality, hemolymph slightly blue to coagulation of the hemolymph in vitro. Blood eggs vortex whipworm infection in three trituberculatus and healthy swimming crab non-specific immunity compared in Table 1 can be seen from Table 1 found to be infected with the whipworm of blood eggs vortex, crab bl
11、ood cells significantly reduced (Figure 3), some samples of blood cell count is almost non-prosecution out health Portunus blood cell number (27 632 4541) the 103cells/mL, the difference very significant (P 0.01). In this study, injection of inactivated parasites by treatment, may have changed the s
12、urface antigenic structure, but the the portunid immune defense system can quickly identify and respond to many similar parcels group structure, but also found some small pieces of crab gills of naturally infected , indicating that part of the blood egg vortex whipworm blood cells to identify and cl
13、ear the parcel, but there are still a large part of the blood egg vortex whipworm can not be successfully cleared. Under natural infection status, it seems that this immune defense mechanism of the vortex of some live blood of eggs whipworm lost a role, suggesting that in vivo blood eggs vortex whip
14、worm antigen there may be some special mechanism to avoid 3 swimming crabs immune system and thus a large number of breeding led to the swimming crab death, yet to be confirmed by further studies. Key words Three trituberculatus; Infection; Blood eggs vortex whipworm 4 血卵涡鞭虫感染对三疣梭子蟹非特异性免疫指标的影响 1. 前言
15、 1.1 三疣梭子蟹的养殖 状况 三疣梭子蟹（ Portunus trituberculatus）隶属甲壳纲、十足目、梭子蟹科、梭子蟹属，属大型海产经济蟹类，在我国北方辽东半岛一直到南海海域均有分布，因其肉味鲜美、营养丰富、深受 消费者喜爱 1。为浙江省名牌养殖海产品，具有较强区域优势，总养殖总面积占全国养殖养殖面积 1/3，总产量的 1/2，已形成梭子蟹养殖、加工、出口一条龙的规模性产业。 1.2 三疣梭子蟹养殖出现的问题 随着市场需求的日益提升，梭子蟹海水养殖规模发展迅猛，但由于梭子蟹配合饲料尚未解决，饵料投喂依然以张网捕捞低质小杂鱼及贝类为主，整个养殖过程需大排大灌以维持水质，因此养殖方
16、式较为粗放，整体管理水平相对较低，不可避免的导致梭子蟹遭受各种病害的侵袭，目前报道的梭子蟹病原包括：血卵涡鞭虫 (Hematodinium sp.) 2、纤毛虫、溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus) 4、假丝酵母菌 (Candida olephila) 5、孢子虫等，其中以血卵涡鞭虫危害最为严重，流行发病期在每年 6-11 月份， 7-9 月份高水温期为发病高峰，会在短时间内造成严重死亡，给我省养殖户造成巨大经济损失。 1.3 血卵涡鞭虫的感染状况 血卵涡鞭虫是一种危害海水甲壳类动物的寄生性原生动物，已报道流行于：澳大利亚、阿拉斯加、苏格兰、加拿大以及美国东部阿拉斯加沿岸等地
17、，感染宿主包括：挪威龙虾 (N. norvegicus)、 兰蟹 (C. Sapidus)、白氏雪蟹 (C. bairdi)以及蛛雪蟹 (C. opilo)等许多重要经济甲壳类的渔业生产 2。 1.4 甲壳动物免疫防御机制 疾病的防御除了依赖各种药物之外，更多的还需依靠养殖动物自身免疫能力的提升。很多研究均证实虽然低等的甲壳类动物尚不具备脊椎动物的完整免疫系统，但当其受到寄生虫、细菌真菌等病原侵袭时，其自身非特异性免疫系统也会进行积极的主动防御 6。赵青松等在三疣梭子蟹血淋巴中检出 6 种免疫防御相关酶，包括酸、碱性磷酸酶 (ACP、 AKP)、超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化物酶 (POD
18、)、酚氧化物酶 (PO)和溶菌酶 (LZM)等 7，。宋晓玲等发现感染白斑病毒（ WSSV）后的对虾血淋巴细胞数量大幅下降 ,凝固能力差 ,说明对虾在应对病毒感染时调动了大量血细胞进行了免疫防御 8。 本文对感染血卵涡鞭虫的三疣梭子蟹及健康梭子蟹血淋巴中非特异性免疫相关指标进行了对比，并采用台盼蓝染色的血卵涡鞭虫对三疣梭子蟹进行注射后连续取样观察，探究三疣梭子蟹对血卵涡鞭虫颗粒的免疫清除机制，以期对三疣梭子蟹寄生虫疾病的免疫相关防治技术提供理论参考。 2. 材料与方法 2.1 试 验材料 试验用仪器： NIKON 80i 显微镜， BIO-RAD PCR 仪， 722 型分光光度计。 5 试验
19、用血卵涡鞭虫感染梭子蟹样本均于 2011年 8月采集于舟山市朱家尖某梭子蟹养殖塘（见图 1），采集疑似雄性感染样本共 48 只（ 22.3 3.8g）；健康蟹采集于临近养殖塘，共采集雄性样本 20 只（ 24.6 4.3g）。疑似感染样本及健康蟹均采用显微镜检及 PCR 诊断筛选，分组后采样分析；试验用注射感染样本捕捞于浙江省海洋水产研究所西轩岛试验场梭子蟹养殖塘，雄性 30 只 (121g 16g)，平均分为 6 组，以充氧机充气暂养于 100L 的塑料桶中。 图 1. 感染血卵涡鞭虫的梭子蟹养殖塘 注射用血卵涡鞭虫采集于感染血卵涡鞭虫濒临死亡梭子蟹样本，从游泳足基膜处采用无菌注射器抽取病蟹
20、血淋巴， 0.5%福尔马林固定 24 小时后，经 5 次低速离心（ 1000r/min）无菌海水洗涤后备用。 各种免疫酶检测试剂盒均购买自南京建成生物工 程研究所。 2.2 试验方法 2.2.1 血卵涡鞭虫感染梭子蟹与健康梭子蟹非特异性免疫指标的检测 血淋巴及肝胰腺样品采集 对采集的 48只疑似感染梭子蟹样本及 20只健康梭子蟹先用 洁净毛巾擦干体表水分，然后用酒精棉球擦拭其游泳足基膜部位，用已抽取 0.5mL 福尔马林（浓度 0.5%）的 1mL 无菌注射器抽取血淋巴 0.5mL 用于血卵涡鞭虫感染初筛及血细胞计数；抽取血淋巴 0.2ml 用于血卵涡鞭虫的 PCR 诊断；另外尽可能多的采集血
21、淋巴，装入离心管， 37静置 2 小时， 4过夜， 6000r/min 4离心采集上清 ，分装后保存于 -70用于非特异性免疫指标的测量。以无菌剪刀取一小块梭子蟹肝胰腺组织放入离心管冻存于 -70用于肝胰腺抗氧化能力的检测。 血卵涡鞭虫诊断与分组 采用 NIKON 80i 显微镜对样本血淋巴进行初筛，并采用针对 血卵涡鞭虫 ITS1 基因特异性引物 Primer 1： 5 -CTGATTACGTCCCTGCCCTT-3； Primer 2：5 -GCATGTCGCTGCGTTCTTC-3进行 PCR 扩增，进行更为准确的血卵涡鞭虫诊断。 扩增程序： PCR 反应体系（ 25 L）为： 2.5
22、L10 buffer、 2 L dNTP（ 2.5mM）、 Primer 1 和 Primer 2 (25 M)各 0.25 L、 Taq DNA 聚合酶 0.2 L、模板 0.5 L，用灭菌去离子水补充反应总体积至 25 L，将混合物置 PCR 仪中反应。 PCR 循环参数： 94 预变性 5min后开始循环， 94 45s、 55 45s， 72 1min，共 35 个循环，最后 72延伸 7min。 5 L PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外凝胶成像仪中照相记录 ,以出现 585bp 左右条带为血卵涡鞭虫阳性样本（参见参考文献 7）。 选取感染严重的 10 个样本及 10 个健康样本用
23、于非特异性免疫指标的分析比较。 6 非特异性免疫指标测定方法 对上述感染血卵涡鞭虫梭子蟹及健康梭子蟹样本进行如下非特异性免疫指标进行检测：包括：血淋巴血细胞总数、超氧化物歧化酶（ SOD）、酸性磷酸酶 ACP 活性、一氧化氮（ NO）含量和肝胰腺总抗氧化能力（ T-AOC）等。 其中血细胞计数采用 25 16 规格的血球计数板计数，每个样本计数 3 次取平均值。 SOD 采用方法 :通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶系统反应产生超氧阴离子自由基（ O2-），后者能氧化羟胺形成亚硝酸盐，与显色剂作用能呈现紫红色，测定样品中 的 SOD 对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，能亚硝酸盐的形成减少，通过分光光
24、度计比色测定样品管与对照管的吸光值 (DO)，经以下公式： SOD 活力 (U/mL)=(DO 对照管 DO 测定管 )/DO 对照管 50%反应体系稀释倍数样本稀释倍数 计算即可得出样品 SOD 的浓度。 ： ACP 活性采用磷酸苯二钠法，以 100mL 血清在 37与底物作用 60min，产生 1mg 酚为1 个酶活力单位，活性计算公式： 酸性磷酸酶（ U/100mL） = DO 测定管 /DO 标准管标准管含酚量 100ml/0.05ml NO 含量的测定则是利用 NO 性质活泼（可迅速代谢转为 NO2-和 NO3-）的特性，用硝酸还原酶特异性将 NO3-还原为 NO2-，再通过采用硝酸
25、盐显色剂生成红色偶氮化合物来间接测定，通过分光光度计吸光值测定来进行 NO 的定量分析。 肝胰腺中抗氧化能力测定原理是利用肝胰腺中抗氧化物质可将 Fe3+还原为 Fe2+，而Fe2+可与菲啉类物质形成稳定的络合物，通过比色可测定出抗氧化能力的高低。 以上各指标均采用生产自同一批次的南京建成生物工程有限公司的检测试剂盒进行检测，每个样品每个指标测定 2 次取 平均值。 2.2.2 注射台盼蓝染色血卵涡鞭虫虫体对梭子蟹血淋巴的影响 血卵涡鞭虫的台盼蓝染色：将 1.1 中准备好的血卵涡鞭虫用 1.2%台盼蓝染色 10min，再以灭菌海水洗涤离心 5 次，静置过夜后，再以灭菌海水离心洗涤 2 次，稀释
26、后备用，经血球计数板板计数定量，浓度为 2.2 106cells/mL。 用酒精擦拭三疣梭子蟹游泳足基膜处，以 1mL 一次性注射剂吸取已确定浓度的血卵涡鞭虫悬浊液，从基膜处注射 0.1mL 虫体悬浊液。其中 10 只梭子蟹注射灭菌海水作为对照 注射后 5min、 30min、 1h、 48h、 45d 各取样 2 只解剖观察蓝色虫体颗粒处的位置，显微镜观察血淋巴中血细胞变化及鳃等组织的变化。 2.2.3 数据处理 所有测定数据经 EXCEL 数据分析得出平均值与标准差，用 SPSS 11.5 进行单因素方差分析， p0.05 表示差异显著， p0.01 表示差异极显著。 3. 试验结果 3.
27、1 血卵涡鞭虫感染三疣梭子蟹及健康梭子蟹非特异性免疫指标对比 经显微初筛及 PCR 诊断确认，从 50 个疑似样本中选取 10 个严重感染样本作为血卵涡鞭虫感染组，从 20 个健康样本中随机选取 10 个样本作为健康梭子蟹对照，两组间体重 差异不显著。 7 感染样本与健康样本表观差异（图 2）：感染血卵涡鞭虫的梭子蟹普遍活动能力较弱，血淋巴颜色呈白浊状，凝固能力较差，显微镜下可见大量的与梭子蟹血细胞大小类似的血卵涡鞭虫，而健康梭子蟹则活力较强，血淋巴为稍带蓝色，血淋巴在体外一分钟即可凝固。 血卵涡鞭虫感染三疣梭子蟹及健康梭子蟹非特异性免疫指标对比见表 1由表 1可见发现感染血卵涡鞭虫后，梭子蟹
28、血细胞大幅减少（图 3），有的样本血细胞数几乎不可检出，而健康梭子蟹血细胞数在（ 27632 4541） 103cells/mL，差异极显著（ P0.01）。 图 2 严重感染血卵涡鞭虫的三疣梭子蟹，可见血淋巴变不正常的白浊色 Fig1 Heavily Hematodinium sp. infected Portunus trituberculatu， shows the milky-like haemolymph 图 3 感染血卵涡鞭虫后梭子蟹（左）与健康梭子蟹（右）血淋巴显微比较 左：可见大量血卵涡鞭虫虫体（ 1000）右：示大量正常血细胞（ 400） Fig 3 Haemolymph o
29、f Portunus trituberculatu infected by Hematodinium sp（ left 1000），Haemolymph of healthy Portunus trituberculatu（ right 400） 梭子蟹血清中 ACP 活性测定结果健康梭子蟹与感染梭子蟹差异也达到极显著差异的水平，分别为 6.131 1.435U/mL、 1.945 0.447 U/mL； SOD、 NO 测定结果也类似，感染组与健康组均呈现极显著差异。 表 1 感染血卵涡鞭虫的梭子蟹与健康梭子蟹非特异性免疫指标比较 Table1. non-specif ic immune f
30、actors of the healthy and Hematodinium sp infected Portunus trituberculatus 样品 测定指标 血细胞总数 ( 103cells/mL酸 性 磷 酸 酶（ U/100mL） 超氧化物歧 化酶（ U/mL） 一氧化氮 （ mol/L） 肝胰腺总抗氧化能（ U/mgpro） 8 ) 健康 组 276324541 6.131 1.435 55.927 2.955 19.32 3.762 1.122 0.179 感染 组 较少或几乎无 1.945 0.447 37.302 6.393 5.256 2.421 0.520 0.139
31、 3.2 注射台盼蓝染色血卵涡鞭虫虫体对梭子蟹血淋巴的影响 对健康梭子蟹注射血卵涡鞭虫虫体后连续取样观察发现梭子蟹血淋巴系统对注射入体内的血卵涡鞭虫虫体（图 4.1）反应十分迅速： 5min 时，有大量血细胞出现聚团，血淋巴中未见游离蓝色虫体颗粒（图 4.2）； 30min 时，鳃管中发现被细胞团包裹的蓝色虫体块，最大达 1611 m（图 4.3）。鳃片富集蓝色虫体，但是未形成包裹块； 1h 时，虫体循环至另外一端鳃部，心脏中发现少许虫体颗粒，血淋巴中聚团细胞较多，鳃片中虫体周围出现包裹细胞，血液 中未见单个虫体细胞（图 4.4）； 48h 时，两端鳃丝均有大量蓝色虫体，但是以注射一端鳃蓝色虫
32、体较多，鳃叶中形成明显包裹团（图 4.5）。在对自然感染血卵涡鞭虫的梭子蟹鳃小片中也观察到了类似的包裹团结构（图 4.6）。 图 4.1 注射用台盼蓝染色的血卵涡鞭虫虫体（ 40，标尺 50m） Fig 4.1 Hematodinium sp suspension injected into healthy Portunus trituberculatus (bars=50m) 图 4.2 注射 5min 后对照组梭子蟹血淋巴（左 4）与注射组梭子蟹血淋巴（右， 4） 左：可见均匀分布的 正常梭子蟹血细胞 右：可见大量集群的梭子蟹血细胞 Fig 4.2 Haemolymph of Portunus trituberculatu after injected with Hematodinium sp.， left shows the healthy haemolymph cells scattered evenly； right shows the obvious angulations in haemolymph cells.
